張蕊，張威，劉國建，鮑運(yùn)霞

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 腎內(nèi)科，黑龍江 哈爾濱 150086）

慢性低氧是各種腎臟疾病進(jìn)展至終末期腎臟病（end stage renal disease, ESRD）的共同途徑[1-2]。以往的研究大多關(guān)注低氧引起的腎小管間質(zhì)損害，卻較少提及腎小球的低氧性損傷。最近的研究表明腎小球足細(xì)胞的低氧性調(diào)節(jié)可能引起足細(xì)胞裂孔蛋白CD2AP等水平下降，足細(xì)胞骨架蛋白F-actin重組，并參與腎小球硬化的發(fā)展[3-4]。足細(xì)胞是腎小球濾過屏障的關(guān)鍵組成部分，能通過改變足突間裂隙膜的孔徑調(diào)節(jié)腎小球濾過率，足細(xì)胞損傷可引起腎小球濾過率下降和蛋白尿產(chǎn)生[5-6]。已有研究證實(shí)，低氧條件下足細(xì)胞內(nèi)低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia induced transcription factor,HIFs）水平升高，通過調(diào)控足細(xì)胞重要功能基因的轉(zhuǎn)錄改變細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能[4-7]。此結(jié)果提示慢性低氧可能通過足細(xì)胞調(diào)節(jié)機(jī)制參與腎小球損傷和硬化的發(fā)展[7]，但是其具體機(jī)制尚不清楚。

高通量鈣激活鉀通道（簡稱BK通道）是最早發(fā)現(xiàn)的氧敏感性離子通道之一[8-9]，在可興奮性細(xì)胞中，BK通道低氧性抑制引起細(xì)胞膜去極化，激活電壓依賴式鈣通道，導(dǎo)致大量Ca2+內(nèi)流，引發(fā)細(xì)胞的低氧適應(yīng)性改變，從而參與多種組織細(xì)胞的低氧性調(diào)節(jié)[10-12]。本研究組設(shè)想BK通道參與足細(xì)胞低氧的適應(yīng)性調(diào)節(jié)。為證明這項假設(shè)，筆者觀察了低氧對人類足細(xì)胞BK通道表達(dá)和功能的影響，同時對低氧狀態(tài)下BK通道調(diào)節(jié)的可能機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 研究對象

由于腎小球足細(xì)胞為終末分化細(xì)胞，只有分化完全后才能行使正常生理功能，因此研究組選擇條件永生性人類足細(xì)胞系作為研究對象。此類細(xì)胞系特殊轉(zhuǎn)入了溫度敏感性基因，在33℃培養(yǎng)時處于增殖狀態(tài)，轉(zhuǎn)入37℃培養(yǎng)后無需改變培養(yǎng)基成分即停止增殖并開始分化。繼續(xù)培養(yǎng)11～14 d足細(xì)胞可達(dá)完全分化，具有類似人類足細(xì)胞的生理結(jié)構(gòu)和功能。

1.2 實(shí)驗材料

RPMI 1640（美國HyClone公司），胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白及亞硒酸鈉混合液（insulin, transferrin and sodium selenite, ITS）（美國 Sigma公司），10% FBS（美國HyClone公司）。cDNA轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國ABI公司），SYBR Green PCR Master Mix體系（美國ABI公司），ABI PRISM 7500系統(tǒng)（美國ABI公司）。BCA蛋白測定試劑盒（美國Pierce公司），BK通道α、β3和β4亞基抗體（英國Abcam公司）或actin抗體（美國Santa Cruz公司），羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG的熒光二抗（美國Invitrogen公司），Odyssey infrared成像系統(tǒng)（美國Li-COR公司）。電生理實(shí)驗的所有試劑（美國Sigma公司），倒置顯微鏡（日本Nikon公司），電極拉制儀P-97（美國Sutter公司），Axo-patch 200B系統(tǒng)（美國Axon公司），Digidata 1440A interface系統(tǒng)（美國Axon公司），pClamp 10.2軟件（美國Axon公司），Graphpad prism 5軟件（美國GraphPad公司）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)、低氧處理及實(shí)驗分組 條件永生性人類足細(xì)胞系增殖及分化所需培養(yǎng)基成分包括RPMI 1640，ITS和10% FBS，其中ITS能夠促進(jìn)足細(xì)胞的增殖及分化，為培養(yǎng)所必需?？筛鶕?jù)實(shí)驗設(shè)計將分化完全的足細(xì)胞分為3組，分別置于正常氧氣濃度（21% O2）和低氧條件（10%或2% O2）的孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)[8，13-15]。正常氧濃度孵箱內(nèi)氣體成分為21% O2，5% CO2，其余由N2補(bǔ)充。低氧孵箱內(nèi)氣體成分為10%或2% O2，5%CO2，其余由N2補(bǔ)充。在培養(yǎng)的第6、12、24和48 h逐步取出各組細(xì)胞，分別進(jìn)行PCR檢測，Western blot檢測和膜片鉗實(shí)驗，測定各組細(xì)胞BK通道α、β3及β4亞基基因和蛋白的表達(dá)水平，同時記錄BK通道開放電流，比較各組細(xì)胞在常氧和低氧條件培養(yǎng)不同時間點(diǎn)BK通道表達(dá)和功能狀態(tài)，觀察低氧條件對足細(xì)胞BK通道表達(dá)和功能的影響，從而為慢性腎臟病引起的腎小球缺氧狀態(tài)和足細(xì)胞缺氧性BK通道功能調(diào)節(jié)提供理論依據(jù)。另取兩組常氧濃度培養(yǎng)并分化完全的足細(xì)胞，分別加入二甲基烯丙基氧甘氨酸（DMOG，1 mmol/L）或氯化鈷（CoCl2，100μmol/L），制作化學(xué)缺氧模型，測定BK通道亞基和蛋白表達(dá)水平，記錄通道電流，比較其與常氧對照組細(xì)胞BK通道功能和表達(dá)的不同。另取兩組常氧培養(yǎng)的足細(xì)胞，在放入低氧孵箱前分別向培養(yǎng)液中加入還原劑谷胱甘肽乙酯（GSH，1 mmol/L）或過氧化氫酶（Catalase，200 u/ml），比較其與低氧培養(yǎng)組細(xì)胞BK通道亞基表達(dá)和功能的不同，分析其是否參與氧化應(yīng)激機(jī)制。

1.3.2 Real-time PCR 將10μl的反應(yīng)混合物放入逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中。這個過程所使用的RNA總量為0.5 mg，并應(yīng)用高效能cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA的初始合成。所有的real-time PCR實(shí)驗都應(yīng)用SYBR Green PCR Master Mix體系，并在ABI PRISM 7500系統(tǒng)中完成。BK通道蛋白基因的引物序列如下，KCNMA1正向引物：5'-AACCCGCCCTATGAGTTTG-3'，反向引物：5'-GGATGGGATGGAGTGAACAG-3'；KCNMB3正 向引物：5'-GAGAGGACCGAGCCGTGAT-3'，反向引物：5'-CACCACCTAGCAGAGTCAGTGAAG-3'；KCNMB4正向引物：5'-GCGTTCTCATTGTGGTCC-3'，反向引物：5'-TTCCAGTTGTGCCTGTTTC-3'。擴(kuò)增后的成分由ABI Prism genetic analyzer進(jìn)行分析。

1.3.3 Western blot 分化完全的足細(xì)胞用冰PBS液沖洗后，經(jīng)3000 r/min離心10 min，放入含有1%蛋白酶抑制劑的溶液中用于蛋白提取。細(xì)胞裂解產(chǎn)物需在冰上培養(yǎng)15 min，之后以13500 r/min離心15 min。用BCA蛋白測定試劑盒對總蛋白含量進(jìn)行定量分析。隨后蛋白樣本需進(jìn)行10% SDS PAGE凝膠電泳，分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)膜后將硝酸纖維素膜在室溫下用5%脫脂奶封閉2 h，隨后選擇合適的一抗進(jìn)行孵育：BK通道α、β3和β4亞基抗體（1︰200）或actin抗體（1︰500）。沖洗后將硝酸纖維素膜與羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG的熒光二抗（1︰10000）進(jìn)行培養(yǎng)。最后使用Odyssey infrared成像系統(tǒng)對條帶吸光度進(jìn)行分析。

1.3.4 電生理記錄 BK通道電流以全細(xì)胞模式進(jìn)行膜片鉗記錄，微電極使用毛細(xì)硅硼玻璃管在電極拉制儀P-97上拉制完成，所有實(shí)驗均在室溫（20～22℃）下進(jìn)行。在全細(xì)胞記錄模式下，細(xì)胞內(nèi)液成分為15 mmol/L KCl，130 mmol/L K aspartate，1 mmol/L MgCl2，10 mmol/L EGTA，10 mmol/L Hepes及5.76 mmol/L CaCl2（游離Ca2+濃度200 nmol/L）；用KOH調(diào)節(jié)pH值至7.2。標(biāo)準(zhǔn)浴液成分包括145 mmol/L NaCl，4.5 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl2，2 mmol/L CaCl2及 10 mmol/L Hepes；用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.4。傳代在5～15代之間的完全分化足細(xì)胞用于檢測。細(xì)胞的鉗制電壓設(shè)定為-60 mV，記錄電壓在-80～+80 mV之間波動時通道電流的變化。每20 mV記錄1次，每次記錄時間為700 ms。電流由Axo-patch 200B系統(tǒng)放大并經(jīng)1 kHz頻率濾波后，通過Digidata 1440A interface系統(tǒng)進(jìn)行在線記錄。最后應(yīng)用pClamp 10.2軟件獲取數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析。電導(dǎo)率數(shù)據(jù)以G/Gmax表示且符合Boltzmann方程。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0、Photoshop及Graphpad prism 5統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間的比較采用單因素方差分析，兩組比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BK通道電流的確定

通道的反轉(zhuǎn)電位約為-60 mV，接近K+平衡電位（細(xì)胞內(nèi)外的K+濃度分別為145.0和4.5 mmol/L）。將細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度由200 nmol/L提高至5μmol/L時，通道的外向電流水平明顯增加（見圖1A）。在細(xì)胞外液中加入非選擇性K+通道阻斷劑TEA（5 mmol/L）后，+80 mV電壓下的電流水平下降至41%；加入選擇性BK通道阻斷劑Penitrem A（100 nmol/L）[16]后，通道電流下降至29%（見圖1B）。由此證實(shí)誘發(fā)的通道電流完全由BK通道開放所引起。見表1～3。

2.2 慢性低氧對足細(xì)胞BK通道電流的抑制

低氧條件（2%O224 h）下，足細(xì)胞BK通道在+80 mV電壓刺激下的電流水平由（14.45±2.06）pS下降至（4.78±1.12）pS，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且足細(xì)胞的活性無明顯變化。見圖2A、2B及表4。

2.3 慢性低氧上調(diào)足細(xì)胞BK通道β4亞基mRNA及蛋白表達(dá)對α和β3亞基表達(dá)的影響

低氧條件（2% O224 h）下足細(xì)胞BK通道β4亞基mRNA（B4）水平升高，而α和β3亞基mRNA（A1和B3）表達(dá)無明顯變化（見圖3A）。β4亞基mRNA自低氧6 h起開始升高，低氧12～24 h達(dá)峰值，在低氧48 h時有所下降。與基因表達(dá)情況類似，低氧條件下（2% O224 h）BK通道β4亞基表達(dá)增加（見圖3B和表 5）。

2.4 氧化應(yīng)激反應(yīng)參與低氧誘導(dǎo)的BK通道β4亞基表達(dá)上調(diào)

細(xì)胞培養(yǎng)液中加入DMOG（1 mmol/L）或CoCl2（100 μmol/L）孵育24 h并未明顯改變BK通道β4亞基mRNA的表達(dá)（見圖4A）。低氧條件下細(xì)胞外液中加入還原劑谷胱甘肽乙酯（GSH，1 mmol/L）或過氧化氫酶（Catalase，200 u/ml）明顯降低低氧引起的β4亞基mRNA水平升高。見圖4B和表6、7。

圖1 人類腎小球足細(xì)胞BK通道電流的記錄

表1 不同游離鈣濃度對BK通道電流的影響 （±s）

表1 不同游離鈣濃度對BK通道電流的影響 （±s）

電流值電壓值t值 P值游離鈣200 nmol/L 游離鈣5 μmol/L-80 mV -0.225±0.132 -0.204±0.200 0.288 0.776-60 mV 0.005±0.054 -0.015±0.087 0.663 0.515-40 mV 0.253±0.136 0.470±0.173 3.155 0.005-20 mV 0.536±0.272 1.039±0.408 3.385 0.0030 mV 0.937±0.422 1.749±0.647 3.480 0.00320 mV 1.686±0.574 3.291±1.393 3.787 0.00140 mV 3.369±0.777 6.166±3.064 3.288 0.00460 mV 6.685±0.976 11.838±4.025 4.635 0.00080 mV 12.171±1.464 19.168±4.279 5.613 0.000

表2 TEA對BK通道電流的影響 （±s）

表2 TEA對BK通道電流的影響 （±s）

電流值電壓值t值 P值對照組 TEA組-80 mV -0.211±0.130 -0.175±0.104 0.543 0.597-60 mV 0.028±0.047 -0.018±0.035 1.886 0.084-40 mV 0.286±0.143 0.110±0.071 2.542 0.026-20 mV 0.586±0.278 0.350±0.110 1.797 0.0980 mV 1.000±0.396 0.581±0.179 2.216 0.04720 mV 1.787±0.428 1.115±0.167 3.325 0.00640 mV 3.527±0.427 1.939±0.299 7.319 0.00060 mV 6.873±0.607 3.285±0.352 12.010 0.00080 mV 12.380±1.139 5.041±0.372 13.788 0.000

表3 Penitrem A對BK通道電流的影響 （±s）

表3 Penitrem A對BK通道電流的影響 （±s）

電流值電壓值t值 P值對照組 Penitrem A組-80 mV -0.211±0.130 -0.258±0.181 0.527 0.609-60 mV 0.028±0.047 -0.002±0.046 1.055 0.314-40 mV 0.286±0.143 0.280±0.135 0.073 0.943-20 mV 0.586±0.278 0.561±0.183 0.165 0.8720 mV 1.000±0.396 0.903±0.287 0.439 0.66920 mV 1.787±0.428 1.333±0.404 1.793 0.10040 mV 3.527±0.427 1.896±0.544 5.874 0.00060 mV 6.873±0.607 2.642±0.684 11.197 0.00080 mV 12.380±1.139 3.619±0.709 14.027 0.000

表4 低氧對足細(xì)胞BK通道電流的影響 （±s）

表4 低氧對足細(xì)胞BK通道電流的影響 （±s）

電流值電壓值t值 P值常氧濃度 低氧濃度-80 mV -0.277±0.203 -0.088±0.042 2.403 0.028-60 mV 0.114±0.189 0.103±0.145 0.130 0.896-40 mV 0.520±0.560 0.030±0.047 2.283 0.036-20 mV 0.990±0.876 0.002±0.002 2.948 0.0090 mV 1.532±1.222 0.169±0.186 2.897 0.01020 mV 2.571±1.598 0.690±0.578 2.972 0.00940 mV 4.629±1.793 1.441±1.099 4.234 0.00160 mV 8.135±1.899 2.091±1.355 7.359 0.00080 mV 13.807±2.272 3.504±1.591 10.530 0.000

圖2 慢性缺氧抑制人類腎小球足細(xì)胞BK通道電流

圖3 慢性缺氧對BK通道亞基mRNA和蛋白表達(dá)的影響

表5 慢性缺氧對BK通道亞基mRNA和蛋白表達(dá)的影響（±s）

表5 慢性缺氧對BK通道亞基mRNA和蛋白表達(dá)的影響（±s）

表達(dá)量mRNA和亞基t值 P值常氧濃度 低氧濃度KCNMA1 1.445±0.527 0.944±0.606 1.248 0.259 KCNMB3 1.075±0.406 1.146±0.373 0.257 0.806 KCNMB4 1.447±0.692 4.137±1.359 3.529 0.012 α-subunit 3.900±1.271 4.109±1.132 0.245 0.815 β3-subunit 13.286±1.553 13.846±0.907 0.622 0.557 β4-subunit 6.511±1.459 11.497±2.188 3.791 0.009

表6 DMOG和CoCl2對β4亞基mRNA表達(dá)的影響（±s）

表6 DMOG和CoCl2對β4亞基mRNA表達(dá)的影響（±s）

組別 mRNA表達(dá)量 F值 P值常氧對照組 7.274±0.3350.415 0.678 DMOG組 7.420±0.342 CoCl2組 7.178±0.307

圖4 氧化應(yīng)激反應(yīng)參與缺氧誘導(dǎo)的β4亞基mRNA表達(dá)上調(diào)

表7 GSH和Cata對β4亞基mRNA低氧性上調(diào)的影響（±s）

表7 GSH和Cata對β4亞基mRNA低氧性上調(diào)的影響（±s）

組別 mRNA表達(dá)量 F值 P值常氧對照組 7.754±0.4750.047 0.954 Hypo+GSH組 7.803±0.415 Hypo+Cata組 7.637±0.998

3 討論

足細(xì)胞低氧性損傷在腎小球疾病的進(jìn)展中具有重要作用[6]。BK通道被認(rèn)為是參與低氧反應(yīng)的關(guān)鍵角色。大多數(shù)組織中BK通道表現(xiàn)為低氧性功能抑制，如頸動脈體、動脈平滑肌細(xì)胞、中樞神經(jīng)元和心肌細(xì)胞等。在這些組織細(xì)胞中，缺氧性BK通道抑制引起細(xì)胞膜去極化，從而激活電壓依賴式鈣通道，繼而導(dǎo)致大量Ca2+內(nèi)流，引發(fā)細(xì)胞的缺氧適應(yīng)性改變。本研究表明在腎小球足細(xì)胞中，低氧可引起B(yǎng)K通道功能抑制，電流水平明顯降低。

BK通道主要由成孔α亞基和調(diào)節(jié)性β亞基構(gòu)成。目前為止已經(jīng)克隆出哺乳動物BK通道的4種β亞基，β1～β4亞基分別由相應(yīng)的KCNMB 1～4所編碼。人類足細(xì)胞BK通道由α、β3及β4亞基組成。本研究分子生物學(xué)結(jié)果表明慢性缺氧環(huán)境可以引起足細(xì)胞BK通道β4亞基mRNA和蛋白表達(dá)水平上調(diào)，而對BK通道的成孔α亞基和調(diào)節(jié)性β3亞基的表達(dá)無明顯影響，提示低氧可能通過上調(diào)β4亞基表達(dá)抑制足細(xì)胞BK通道功能。此結(jié)果與腦組織中的BK通道低氧性調(diào)節(jié)類似[17]。神經(jīng)元的β4亞基被認(rèn)為是BK通道的“下調(diào)因子”，可以使通道激活電壓向去極化方向移動，減慢BK通道的激活動力學(xué)過程。同樣在心肌細(xì)胞和動脈平滑肌細(xì)胞中β亞基也參與了低氧誘導(dǎo)的BK通道活性抑制[17-19]。因此，研究結(jié)果提示低氧通過上調(diào)β4亞基表達(dá)抑制足細(xì)胞BK通道功能。同時本研究組還發(fā)現(xiàn)用還原劑GSH和Catalase預(yù)處理的足細(xì)胞顯著降低低氧誘導(dǎo)的BK通道β4亞基表達(dá)上調(diào)，提示ROS激活參與了足細(xì)胞BK通道β亞基表達(dá)的低氧性調(diào)節(jié)。以上數(shù)據(jù)提示慢性缺氧對β4亞基表達(dá)的影響至少發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平[20]。幾乎所有的細(xì)胞類型對于慢性缺氧（數(shù)小時至數(shù)天）的適應(yīng)性反應(yīng)都依賴于影響多種基因表達(dá)水平的轉(zhuǎn)錄機(jī)制。然而對于影響B(tài)K通道重塑過程（包括亞基的翻譯、裝配、轉(zhuǎn)運(yùn)，以及以上過程的組合形式）的多種機(jī)制還不清楚。

雖然本研究組的結(jié)果表明低氧對α亞基表達(dá)無明顯影響，但是許多其他研究提示α亞基參與BK通道的低氧性調(diào)節(jié)。BK通道α亞基的羧基端上具有血紅素結(jié)合保守序列，可以與血紅素直接結(jié)合[21-22]。另外，BK通道α亞基與血紅素加氧酶2（HO-2）相關(guān)聯(lián)，HO-2使血紅素在有氧條件下與NADPH細(xì)胞色素P450還原酶結(jié)合產(chǎn)生一氧化碳NO。NO可以直接提高原位和重組BK通道的活性。而低氧條件降低了NO的有效性，從而導(dǎo)致通道關(guān)閉。因此HO-2被認(rèn)為是BK通道的酶聯(lián)氧感受器[20，23]。與酶聯(lián)機(jī)制不同，BK通道也可以被細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的瞬間變化（Ca2+火花）激活。Ca2+火花可以使肌槳網(wǎng)內(nèi)的Ca2+濃度以微摩爾的級別增加，從而迅速達(dá)到激活BK通道的水平[24]。對腦動脈平滑肌細(xì)胞[25]和穩(wěn)定表達(dá)BK通道α亞基和β亞基的HEK293細(xì)胞[26]進(jìn)行內(nèi)面向外式膜片鉗記錄發(fā)現(xiàn)，在不添加任何酶類底物的情況下，缺氧以細(xì)胞內(nèi)Ca2+依賴的模式抑制BK通道活性。這些數(shù)據(jù)提示缺氧通過非膜限制機(jī)制減少Ca2+火花和BK通道的有效耦聯(lián)，進(jìn)而引起B(yǎng)K通道活性抑制。但是也有人提出BK通道對氧濃度敏感性的保持是由于在通道蛋白羧基端的壓力調(diào)節(jié)性外顯子中有一段高度保守的富含半胱氨酸的序列[10]。本研究中低氧對足細(xì)胞BK通道α亞基表達(dá)無明顯影響，可能與筆者檢測的通道蛋白為細(xì)胞總蛋白有關(guān)。因此本研究組將進(jìn)一步測定細(xì)胞膜BK通道α亞基的表達(dá)，從而明確其在足細(xì)胞缺氧性調(diào)節(jié)中的作用。