劉艷婷，于晶，王紅偉，于小玲

（青島大學基礎醫(yī)學院 生理與病理生理學系，山東 青島 266021）

姜黃素（Curcumin, Cur）是從姜科植物姜黃的根莖中分離出來的一種多酚類物質(zhì)，作為一種天然的著色劑和調(diào)味劑添加在食品中，后期研究發(fā)現(xiàn)姜黃素還具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗菌等多種生物學作用[1-2]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素灌胃對順鉑[3]、外源性一氧化碳NO，以及阿托品[4]造成的小鼠胃腸功能障礙均有顯著的改善作用。進一步研究顯示姜黃素可通過促進乙酰膽堿（Acetylcholine, Ach）釋放而改善順鉑所致的胃排空障礙[3]。姜黃素對單純功能性胃排空障礙是否也通過Ach途徑發(fā)揮改善作用需要進一步確認。因Ach釋放后迅速被乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase, AchE）水解成膽堿和乙酸，所以本研究通過檢測小鼠胃組織中膽堿的數(shù)量變化得到AchE活力，從而反映Ach的釋放量。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑

健康昆明種雄性小鼠54只，體重20～22 g，購自山東省魯抗醫(yī)藥股份有限公司質(zhì)檢中心實驗動物室。姜黃素（純度99.9%）、鹽酸左旋精氨酸（L-精氨酸）購自美國Sigma-Aldrich公司，阿托品注射液購自天津藥業(yè)集團新鄭股份有限公司，AchE試劑盒購自南京建成生物工程研究所，RNA提取試劑盒購自美國Omega公司，逆轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量聚合酶鏈反應試劑盒購自瑞士羅氏生物科技有限公司，AchE、GADPH引物由上海生工生物有限公司設計合成，免疫印記技術(shù)測定的試劑購自美國Sigma公司，AchE（Cat.NO.bs-2511R）、β-actin抗體（Cat.NO.bs-0061R）購自中國Bioss公司。姜黃素與5%質(zhì)量分數(shù)的阿拉伯膠溶液配成濃度為25 g/L的混懸液，L-精氨酸使用時與5%質(zhì)量分數(shù)的阿拉伯膠溶液配成濃度為250 g/L的混懸液。阿托品與生理鹽水配成0.075 g/L的混合液。

1.2 動物分組與處理

小鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為對照組、姜黃素組、L-精氨酸組、阿托品組、姜黃素+L-精氨酸聯(lián)合組、姜黃素+阿托品聯(lián)合組，共6組，每組9只。對照組、L-精氨酸組、阿托品組給予溶媒溶液灌胃，1次/d，0.2 ml/次，共15 d。姜黃素組、姜黃素+（L-精氨酸）聯(lián)合組、姜黃素+阿托品聯(lián)合組給予姜黃素（200 mg/kg）混懸液灌胃，1次/d，0.2 ml/次，共15 d。從灌胃的第11天開始，L-精氨酸組、姜黃素+（L-精氨酸）聯(lián)合組分別給予0.2 ml L-精氨酸（2 g/kg）混懸液灌胃，1次/d，0.2 ml/次，共5 d。阿托品組、姜黃素+阿托品聯(lián)合組于小鼠測量胃排空前40 min腹腔注射阿托品（0.5 mg/kg）混合液1次。其余組給予等量溶媒溶液灌胃及生理鹽水腹腔注射作為對照。

1.3 胃排空率的檢測

在末次灌胃結(jié)束后，各組小鼠禁食24 h并自由飲水，處死小鼠前20 min時，分別給予0.8 ml 80%質(zhì)量分數(shù)的亞甲藍混懸液灌胃。脫臼處死小鼠并腹腔解剖，結(jié)扎胃賁門部和幽門部，切取胃并稱其全質(zhì)量，然后洗去胃內(nèi)容物，再次稱取胃凈質(zhì)量，計算胃排空率。胃排空率（%）=1-（胃全質(zhì)量-胃凈質(zhì)量）/0.8 ml亞甲藍混懸液質(zhì)量×100%。

1.4 胃組織AchE活力的檢測

分別取各組小鼠的新鮮胃組織，用高通量組織勻漿機研磨成10%體積分數(shù)的組織勻漿，低溫離心后取上清液。嚴格按照AchE試劑盒說明書進行操作，反應結(jié)束后將最終顯色的反應液轉(zhuǎn)移到96孔板，使用全自動酶標儀檢測在波長412 nm時的吸光度值，然后根據(jù)每毫克組織蛋白計算組織勻漿中AchE活力。

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應對胃組織AchE mRNA的檢測

取冷藏于-80℃冰箱的各組胃組織50 mg，用硅膠柱純化方式提取胃組織的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用LightMix?試劑盒進行實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR），以GAPDH作為內(nèi)參。反應條件為 ：95℃ 3 min，95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 30 s，共40個循環(huán)。每樣本采用3管，計算其平均Ct值。采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。AchE正向引物：5'-ACCTGCTTCTCCCACACCT-3'，反向引物：5'-GGTTCCCACTCGGTAGTTCA-3'；內(nèi)參照GAPDH基因正向引物：5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3'，反向引物：5'-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'。

1.6 Western blot法檢測AchE

提取各組小鼠胃組織蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。將轉(zhuǎn)移好的PVDF膜浸入脫脂奶粉中以阻止后續(xù)非特異性結(jié)合；PBST洗滌3次后用AchE抗體孵育1 h（37℃）；再用同樣方法洗滌、孵育二抗；洗滌之后在PVDF膜上滴加DAB發(fā)光染色液，在數(shù)碼冷光成像分析系統(tǒng)中成像，然后分析條帶灰度值，并與相應β-actin的灰度值比較得到相對值。

1.7 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊的條件，組間兩兩比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對L-精氨酸所致的小鼠胃排空障礙及AchE的影響

與對照組比較，L-精氨酸組小鼠胃排空率降低（t=4.684，P=0.000），AchE mRNA、AchE蛋白表達及AchE活力均下降（t=7.250、6.626和4.933，均P=0.000）；與L-精氨酸組比較，姜黃素+（L-精氨酸）聯(lián)合組小鼠胃排空率改善（t=3.153，P=0.003），AchE mRNA、AchE蛋白表達及AchE活力均升高（t=4.165、3.718 和 2.936，P=0.000、0.001 和 0.007）；姜黃素 +（L-精氨酸）聯(lián)合組與對照組比較上述指標差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。單用姜黃素組與對照組比較上述指標差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1和附圖。

2.2 姜黃素對阿托品所致的小鼠胃排空障礙及AchE的影響

由表2和附圖可見，與對照組比較，阿托品組胃排空率降低（t=6.855，P=0.000），其AchE mRNA、AchE蛋白表達及AchE活力均降低（t=6.559、5.454和4.094，均P=0.000）；與阿托品組比較，姜黃素+阿托品聯(lián)合組胃排空率改善（t=6.398，P=0.000），其AchE mRNA、AchE蛋白表達及AchE活力均升高（t=3.204、2.978和3.827，P=0.005、0.010和0.003），上述指標雖未完全恢復至正常，但與對照組比較差異已無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。單用姜黃素組與對照組比較上述指標差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 姜黃素對L-精氨酸所致的小鼠胃排空及 AchE 的影響 （n =9，±s）

AchE活力/（u/mg）對照組 68.94±10.96 1.00±0.20 0.78±0.13姜黃素組 62.00±13.84 0.89±0.20 0.70±0.16 L-精氨酸組 41.43±13.78 0.47±0.09 0.50±0.11姜黃素+（L-精氨酸）聯(lián)合組 60.32±11.54 0.80±0.22 0.69±0.19組別 胃排空率/% AchE mRNA表達F值 8.440 18.348 6.395 P值 0.000 0.000 0.002

表2 姜黃素對阿托品所致的小鼠胃排空率及 AchE 的影響 （n =9，±s）

表2 姜黃素對阿托品所致的小鼠胃排空率及 AchE 的影響 （n =9，±s）

AchE 活力/（u/mg）對照組 68.94±10.96 1.00±0.15 0.77±0.14姜黃素組 62.00±13.84 0.93±0.20 0.74±0.18阿托品 37.77±8.12 0.58±0.12 0.49±0.15姜黃素+阿托品聯(lián)合組 63.75±9.08 0.82±0.19 0.72±0.10 F值 14.539 18.348 7.241 P值 0.000 0.000 0.001組別 胃排空率/%AchE mRNA表達

附圖 各組小鼠胃組織中AchE蛋白表達

3 討論

L-精氨酸和阿托品均可造成功能性胃腸蠕動障礙。其中L-精氨酸是NO前體，在體內(nèi)被一氧化氮合酶（nitricoxide synthase, NOS）催化生成NO，NO由鳥苷酸環(huán)化酶激活經(jīng)環(huán)磷酸鳥苷[5]，作用于化學門控的鈣釋放通道，引起細胞內(nèi)Ca2+庫釋放的Ca2+減少，從而松弛胃腸道平滑肌，抑制胃腸道蠕動。也有研究認為NO可直接抑制Ach的釋放而起松弛平滑肌的作用[6]。阿托品作為M膽堿受體阻斷劑能夠阻斷Ach與相應受體結(jié)合，從而使胃腸平滑肌松弛，降低胃腸蠕動的頻率和幅度，從而使胃腸蠕動障礙。兩者造成胃腸蠕動障礙均與Ach有關(guān)，Ach作為胃腸的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，由神經(jīng)末梢釋放后，與M膽堿能受體結(jié)合，激活G蛋白[7]與磷脂酶C結(jié)合分解生成第二信使，從而參加一系列級聯(lián)反應，引起細胞內(nèi)Ca2+增加，引起平滑肌收縮[8]。與膽堿受體結(jié)合后和未與膽堿受體結(jié)合的Ach迅速被AchE水解成膽堿和乙酸被回收到神經(jīng)末梢作為生成Ach的原料。本研究中采用的試劑盒就是通過檢測膽堿的數(shù)量得到AchE的活力，從而反映Ach的釋放量。結(jié)果顯示，在L-精氨酸和阿托品造成功能性胃排空障礙時，胃組織中AchE活力降低并且mRNA和蛋白的表達量下降，說明外源性NO和阿托品引起的胃排空障礙均與Ach釋放減少有關(guān)。給予姜黃素灌胃后可以顯著改善NO和阿托品所致的胃排空障礙，并且AchE的活力和mRNA以及蛋白表達均得到改善，說明姜黃素可能通過促使Ach釋放改善胃排空。

姜黃素在體內(nèi)如何增加胃組織Ach釋放目前尚不清楚。本實驗室以往研究顯示在順鉑造成的胃腸損傷中，姜黃素可抑制小鼠胃組織NOS的活性從而減少NO的產(chǎn)生[9]，姜黃素抑制NO產(chǎn)生的作用在其他研究中同樣得到驗證[10-11]。如前所述，NO可以抑制Ach而松弛平滑肌[6，12]，因而推測在L-精氨酸模型中，姜黃素可能是通過抑制胃組織NO產(chǎn)生進而增加Ach釋放，從而改善胃排空，這可能是姜黃素發(fā)揮作用的機制之一。在阿托品模型中，姜黃素預先灌胃使Ach釋放量增加的具體機制尚不清楚，但是姜黃素對多種疾病模型中Ach以及AchE的研究有類似報道。服用姜黃素的大鼠可提高機體中谷胱甘肽水平及AchE活性，可以減輕秋水仙素引起的大鼠因脂質(zhì)過氧化而產(chǎn)生的認知功能障礙[13]。姜黃素可使鎘中毒小鼠腦內(nèi)AchE的活力顯著提高并且呈現(xiàn)劑量依賴性[14]。姜黃素還促進大鼠腦組織Ach釋放，這是改善因β-淀粉樣蛋白誘導的炎癥反應所致的阿爾茨海默病的機制之一[15]。

綜上所述，在外源性NO和阿托品造成的兩種功能性胃排空障礙的模型中，姜黃素均可通過影響Ach的釋放而改善小鼠的胃排空，這也為將來姜黃素對胃腸功能的研究提供思路。姜黃素的藥理作用廣而毒副作用小，近期又制備出了提高姜黃素溶解性的復合材料[16]，相信未來一定有廣闊的前景。