賴宏剛， 蔣云升， 張元嵩， 曹 宏， 肖 歡

(1.揚州大學旅游烹飪學院，江蘇揚州 225127； 2.江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所，江蘇揚州 225007

冷鮮雞是指經(jīng)檢疫檢驗后屠宰得到的雞胴體，經(jīng)迅速冷卻使其溫度在1 h內降到0～4 ℃，并保持在0～4 ℃下加工、流通和零售的鮮雞肉[1]。冷鮮雞在生產(chǎn)、加工和儲運過程中，不可避免地會被空氣、容器、包裝材料、原料本身等所攜帶的細菌污染，又因為其營養(yǎng)成分豐富和含水量高[2]，一旦條件適宜，其攜帶的微生物就會迅速生長繁殖，出現(xiàn)變色、變味以及表面發(fā)黏、產(chǎn)生臭味等不良變化[3]，從而使其貨架期縮短，這也成為限制冷鮮雞產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。因此，建立系列的綜合保鮮技術研究就成為解決冷鮮雞及醬雞制品發(fā)展的關鍵問題，而腐敗菌的分離鑒定是這個問題得以解決的基礎。

本研究采用平板劃線分離方法分離純化冷鮮雞中的優(yōu)勢微生物菌群，再通過傳統(tǒng)的生理生化試驗及16S rDNA測序的方法，對冷鮮雞中的主要腐敗菌進行菌種鑒定，從而為靶向控制冷鮮雞加工過程中的微生物生長提供依據(jù)，達到延長貨架期的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

活雞，購于當?shù)亟瘀位▓@菜市場，經(jīng)獸醫(yī)檢驗檢疫合格[4]。聚乙烯(polyethylene，簡稱PE)食品包裝袋，購自江陰市永達復合包裝有限公司。

1.2 試劑

蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、瓊脂、無水氯化鈉、無水硫酸鉀、甘油、磷酸鹽緩沖液、二苯胺、醋酸、檸檬酸銨、乙酸鈉、吐溫-80、硫酸鎂、硫酸錳、CaCO3、膽鹽、H2SO4、H2O2、石蠟、中性紅、結晶紫、MgSO4、KHPO4、D-甘露醇、檸檬酸及其他化學試劑均為分析純級別；1%酚紅溶液、無菌生理鹽水、革蘭氏染色液、奈氏試劑、格里斯氏試劑、吲哚試劑，為筆者自行配制；微量生化反應管，購自杭州天和微生物試劑有限公司；Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒，購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

1.3.1 培養(yǎng)基的配制 (1)平板計數(shù)瓊脂(plate count agar，簡稱PCA)培養(yǎng)基，用于細菌的培養(yǎng)。主要配方如下：5.0 g胰蛋白胨，2.5 g酵母浸膏，1.0 g葡萄糖，15 g瓊脂，1 000 mL蒸餾水，將pH值調至7.2±0.02，于121 ℃滅菌15 min。(2)假單胞菌計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(Pseudomonades培養(yǎng)基)，用于假單胞菌的分離培養(yǎng)。主要配方如下：20 g蛋白胨，5 g無水氯化鈉，1 g無水硫酸鉀，13.6 g瓊脂，10 mL甘油，1 000 mL蒸餾水，將pH值調至7.2，于 121 ℃ 滅菌15 min。(3)乳酸菌計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(MRS)，用于乳酸桿菌的分離培養(yǎng)。主要配方如下：2 g檸檬酸銨，5 g乙酸鈉，20 g葡萄糖，1 mL吐溫-80，0.58 g硫酸鎂，0.25 g硫酸錳，15 g瓊脂，20 g CaCO3，1 000 mL 蒸餾水，將pH值調至6.2～6.4，于121 ℃滅菌 15 min。(4)結晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂(VRBGA)培養(yǎng)基，用于腸桿菌的分離培養(yǎng)。主要配方如下：3 g酵母浸膏，7 g 蛋白胨，1.5 g膽鹽，5 g氯化鈉，10 g乳糖，0.03 g中性紅，0.002 g結晶紫，15 g瓊脂，1 000 mL蒸餾水，將pH值調至 7.3～7.5，于121 ℃滅菌15 min。(5)熱殺索絲菌計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(STAA)，用于熱殺索絲菌的分離培養(yǎng)。主要配方如下：20 g 蛋白胨，15 g甘油，1 g MgSO4，2 g酵母提取物，1 g KHPO4，13 g瓊脂，溶于 1 000 mL 蒸餾水。滅菌后，加入下列滅菌的水溶液：50 μg/mL 鏈霉素硫酸鹽，50 μg/mL環(huán)己六亞胺，50 μg/mL乙酸鹽。

1.3.2 培養(yǎng)條件 本研究中腐敗菌微生物的培養(yǎng)條件見表1。

1.3.3 主要儀器與設備 3730XL型測序儀，Applied Biosystem；FR980型凝膠成像儀，上海復日科技儀器有限公司；DYCP-31DN型DNA電泳槽，北京六一儀器廠；DYY-5型穩(wěn)壓電泳儀，北京六一儀器廠；2720thermal cycler型PCR儀，Applied Biosystems；HC-2518R冷凍高速離心機，上海伊沐醫(yī)療器械有限公司；DK-8D型電熱恒溫水槽，上海一恒科學儀器有限公司；BCD-203型冰箱，海信(北京)電器有限公司；BL3-120型超聲波清洗機，上海比朗儀器有限公司；DT-200 型電子天平，常熟雙杰測試儀器廠；HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋，臨安同華電器有限公司；HSX-250型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海?，攲嶒炘O備有限公司；pHS-3C型精度pH計，上海精密科學儀器有限公司；QYC-200型全溫培養(yǎng)搖床，上海福瑪實驗設備有限公司；XSP-13A型生物顯微鏡，江南光學儀器廠；YX280B型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器，上海精宏實驗設備有限公司；SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；DHG-9148A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海三申醫(yī)療器械有限公司。

表1 本研究中腐敗菌分離、計數(shù)用培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

1.4 方法

1.4.1 樣品的制備 冷鮮雞制備步驟如下：活雞宰殺→剃毛凈膛→修整清洗→采用濃度為50 mg/L的次氯酸鈉溶液[5]浸泡、淋洗→用冷卻水沖洗、瀝干→真空包裝→4 ℃保藏。

1.4.2 微生物菌相構成分析 冷鮮雞樣品于4 ℃儲存至第10天，樣品腐敗變質。于無菌條件下稱取25 g樣品，剪碎后置于裝有225 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中，均質30 min，取上清，依次作1 ∶10遞增稀釋，每個稀釋度作3個平行，倒入冷至45 ℃的選擇性培養(yǎng)基，放入恒溫培養(yǎng)箱內倒置培養(yǎng)48 h后計數(shù)[6]。

1.4.3 腐敗菌菌種的分離純化 從選擇性培養(yǎng)基上挑取典型菌落，在其相應平板上作劃線分離，分離純化2～3次，將代表性菌株移殖至斜面，保藏備檢[7]。

1.4.4 菌落形態(tài)的觀察 在顯微鏡下觀察已分離純化的單個菌落的大小、顏色、形狀、隆起度、邊緣結構、表面光滑或粗糙度、光澤度、透明度和質地等[8]。通過革蘭氏染色、鞭毛染色及芽孢染色，對重新培養(yǎng) 18～24 h且長勢好的單菌落進行顯微鏡觀察。菌體形態(tài)包括細胞形態(tài)(短桿、長桿及球狀等)；革蘭氏染色分陰性和陽性[9]。

1.4.5 生理生化試驗 根據(jù)《食品微生物鑒定圖譜》及《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[10]，進行氧化酶、接觸酶、葡萄糖氧化發(fā)酵、精氨酸雙水解酶活性以及V-P(Voges-Proskauer)試驗，根據(jù)菌落形態(tài)、菌體形態(tài)和生理生化試驗結果，最終將細菌初步鑒定到科和屬。

1.4.6 腐敗菌的PCR檢測

1.4.6.1 基因組DNA的提取 采用細菌DNA提取試劑盒提取細菌基因組DNA。

1.4.6.2 菌種鑒定基因序列擴增 以基因組DNA為模板，進行細菌16S rDNA片段的PCR擴增，采用通用引物擴增16S rDNA，其中7F：5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′，1540R：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。

PCR反應體系(25 μL)：0.5 μL模板(20～50 ng/μL基因組DNA)，2.5 μL 10×PCR buffer，1 μL dNTP(2.5 mmol/L)，0.2 μL酶，0.5 μL引物F(10 μmol/L)，0.5 μL引物R(10 μmol/L)，加雙蒸水至25 μL。

PCR循環(huán)條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.4.6.3 序列片段分析及發(fā)育樹的構建 將序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，在GenBank中使用BLAST程序進行同源性比較，獲得最相似典型菌株的DNA序列。運用MEGA 6軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹構建。

2 結果與分析

2.1 冷鮮雞中微生物菌相的構成

將冷鮮雞樣品于4 ℃保藏培養(yǎng)第10天，檢測其菌落總數(shù)達到1.2×105CFU/g，其腐敗菌相構成如圖1所示，可見冷鮮雞的腐敗菌相以假單胞菌(占比51.0%)和乳酸菌(占比31.5%)為主，其次是熱殺索絲菌(占比13.3%)、腸桿菌(占比4.3%)。

2.2 菌落形態(tài)特征

將純化得到的菌種分別命名為J1、C1、R1、S1，鑒定得到的菌落特征及菌體形態(tài)見表2。

表2 菌落特征及菌體形態(tài)

注：“+”表示陽性，“-”表示陰性。表3同。

2.3 腐敗菌顯微鏡圖

通過革蘭氏染色試驗初步分析這4種分離得到的細菌。根據(jù)菌體的形態(tài)大小、染色結果初步確定J1、S1為革蘭氏陰性細菌，C1、R1為革蘭氏陽性細菌。此外可以看出，這4株菌并無芽孢(圖2)。

2.4 生理生化鑒定

根據(jù)《食品微生物鑒定圖譜》及《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[10]，通過鏡檢各種菌在顯微鏡下的菌體形態(tài)、革蘭氏染色情況等，結合表3的生理生化試驗結果，初步判定J1為假單胞菌屬，C1為腸桿菌科，R1為乳酸菌屬，S1為環(huán)絲菌屬。

表3 生理生化指標測試結果

注：“NT”表示未檢測。

2.5 16S rDNA基因PCR擴增結果

將分離出的腐敗菌典型菌株的單菌落培養(yǎng)后提取DNA，進行16S rDNA PCR擴增。由圖3可以看出，4株菌得出的條帶大小不同，J1、R1、C1、S1條帶大小分別為1 482、1 351、1 528、1 365 bp。

2.6 系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

將測序所得16S rDNA序列與核酸序列數(shù)據(jù)庫中已知序列進行比對，選取相似性高的菌株序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果如圖4和表3所示。通過同源性比較可得：J1與假單胞菌屬的熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)同源性最高；C1與腸桿菌屬的陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)同源性最高；R1與乳桿菌屬的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)同源性最高；S1與環(huán)絲菌屬的熱殺索絲菌(Brochothrixthermosphacta)同源性最高。

表3 各菌株測序的種屬關系

熒光假單胞菌隸屬于假單胞菌屬。假單胞菌是導致食品腐敗變質的主要微生物，也是冷鮮雞中存在的優(yōu)勢菌[11]。這是因為假單胞菌在低溫條件下也能利用葡萄糖迅速生長繁殖，使肉制品腐敗變質，從而影響其貨架期。冷鮮雞生產(chǎn)加工和保藏期間的溫度為4 ℃，有利于假單胞菌的生長繁殖。

植物乳桿菌隸屬于乳桿菌屬，在有氧時生長差，通常是無氧包裝肉類食品的優(yōu)勢腐敗菌，廣泛存在于動物、蔬菜和食品中[12]。

陰溝腸桿菌隸屬于腸桿菌屬。腸桿菌屬普遍源于人和動物的腸道排泄物，這可能與冷鮮雞在生產(chǎn)、加工和儲運過程中遭到活雞腸道內容物的污染有關[13]。

熱殺索絲菌隸屬于環(huán)絲菌屬，在0～30 ℃下均能生長，主要存在于肉制品中。它也是肉類食品中重要的腐敗菌，因此是引起真空包裝冷鮮雞腐敗的主要微生物[14]。

3 討論

趙文紅等從腐敗冰鮮鴨中鑒定出假單胞菌屬、氣單胞菌屬、乳酸菌屬、腸桿菌屬、節(jié)桿菌屬、紫色桿菌屬等[8]。周濤等對鹽水鵝的主要腐敗菌進行測序和序列比對，得到最終的鑒定結果為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、成團泛菌(Pantoeaagglomerans)[15]。梁慧等通過傳統(tǒng)生理生化試驗鑒定冷鮮雞中腐敗微生物的結果表明，冷鮮雞中腐敗微生物有腸桿菌、葡萄球菌、乳酸菌及假單胞菌，16S rDNA檢測結果表明，冷鮮雞中腐敗微生物含有腸桿菌、葡萄球菌、乳酸菌、節(jié)桿菌、克氏庫克菌及假單胞菌等，兩者相對比有較多相同的微生物[16]。高磊等從變質冷鮮雞的腿肉中分離并通過感官評價篩得到5株優(yōu)勢腐敗菌，經(jīng)菌落特征、菌體形態(tài)、生理生化試驗以及16S rDNA序列分析，結果顯示為類產(chǎn)堿假單胞菌、熱殺索絲菌、腐生葡萄球菌、無色桿菌、液化沙雷氏菌[9]。本研究對貯藏在4 ℃的冷鮮雞進行菌相分析可知，冷鮮雞的腐敗菌相以假單胞菌(51.0%)和乳酸菌(31.5%)為主，其次是熱殺索絲菌(13.3%)、腸桿菌(4.3%)。本研究對分離出的主要腐敗菌進行分離、純化，然后進行菌落特征、菌體形態(tài)觀察及生理生化鑒定，初步確定J1為假單胞菌屬，C1為腸桿菌屬，R1為乳酸菌屬，S1為索絲菌屬。然后提取細菌的16S rDNA，進行PCR擴增后，經(jīng)測序和序列比對，得到最終的鑒定結果：J1為熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)，C1為陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)，R1為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，S1為熱殺索絲菌(Brochothrixthermosphacta)。