侯 瑞， 金巧軍

(1.貴州大學(xué)林學(xué)院，貴州貴陽 550025； 2.西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，陜西楊凌 712100

小麥赤霉病是世界性病害，在亞洲、歐洲、北美洲等均有大流行的報(bào)道[1]。在我國，該病主要流行于長江中下游冬麥區(qū)、華南冬麥區(qū)、黃淮流域冬麥區(qū)、東北三江平原春麥區(qū)等，能夠造成全國范圍的大面積減產(chǎn)，是我國小麥的主要病害和重點(diǎn)防治對(duì)象。小麥赤霉病不但會(huì)造成小麥的嚴(yán)重減產(chǎn)，而且可在感病麥粒中產(chǎn)生大量的真菌毒素，不僅影響小麥的品質(zhì)和質(zhì)量，而且嚴(yán)重危害人、畜的健康[2]。真菌在生長極其緩慢、完全停止或遇到外界壓力的情況下可產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物——真菌毒素[3]。禾谷鐮刀菌是引起小麥赤霉病的主要病原菌[4]，其產(chǎn)生的真菌毒素主要包括脫氧雪腐鐮刀菌烯醇

(deoxynivalenol，簡稱DON)和玉米烯酮(zearalenone，ZEN)。單端孢霉烯族化合物(trichothecenes，簡稱TCTCs)分為類型A和類型B。類型A包含毒素T-2、HT-2、二乙酰蔗草鐮刀菌烯醇(diacetoxyscirpenol，簡稱DAS)等；類型B包含DON及其乙?；苌?3Ac-DON/15Ac-DON)和雪腐鐮刀菌烯醇(14-O-acetyl DON-4-nivalenol，簡稱NIV)等[5]。B型單端孢霉烯化合物類毒素能夠延緩或終止蛋白的生物合成[3]。ZEN是在禾谷鐮刀菌侵染玉米時(shí)檢測到的毒素，是唯一對(duì)人類來說比較溫和的真菌毒素[6]。單端孢霉烯族化合物和玉米烯酮的化學(xué)式見圖1。

1 禾谷鐮刀菌真菌毒素DON生物合成途徑

禾谷鐮刀菌中單端孢霉烯前體合成酶基因TRI5是DON生物合成第1步的關(guān)鍵酶。tri5基因敲除突變體致病力顯著下降，病害癥狀僅在接種的小穗處發(fā)生[7]，表明DON毒素的產(chǎn)生并不是初侵染所必須的，但對(duì)病原菌在穗部的擴(kuò)展卻非常重要。在過去十多年中，參與DON生物合成的TRI基因都已被鑒定出。除了TRI101和TRI1～TRI16外，主要的TRI基因全都在一個(gè)TRI基因簇上(圖2)。其中，TRI6和TRI10基因調(diào)控所有TRI基因的轉(zhuǎn)錄，TRI6基因是主要的轉(zhuǎn)錄因子，TRI10基因起次要作用。TRI6可與TRI10的啟動(dòng)子相結(jié)合并控制其表達(dá)，TRI6的表達(dá)是自我調(diào)控的[8]。TRI1、TRI4、TRI11基因都能編碼P450單氧合酶[9-11]；TRI3基因能夠進(jìn)行C-15的乙?；痆12]；TRI7基因能編碼4-O-乙酰基轉(zhuǎn)移酶[13]；TRI8基因能夠進(jìn)行C-3的脫乙酰化作用[14]；TRI12基因是單端孢霉烯族毒素輸出泵基因，能夠參與毒素的轉(zhuǎn)運(yùn)[15]；TRI19基因的功能尚未知；TRI101基因編碼單端孢霉烯乙酰轉(zhuǎn)移酶[16](表1)。

2 真菌毒素DON生物合成的調(diào)控機(jī)制

目前，國內(nèi)外對(duì)真菌毒素DON生物合成途徑的研究已經(jīng)比較深入，對(duì)此途徑和次生代謝的總體調(diào)控是人們關(guān)注的重點(diǎn)。真菌毒素合成受到內(nèi)因和外因2個(gè)方面的調(diào)控，即由外界環(huán)境因素和體內(nèi)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的共同調(diào)控[17-18]。對(duì)于大多數(shù)真菌來說，某一類的環(huán)境因子，如pH值、碳源、氮源、H2O2等因子能夠和體內(nèi)一些信號(hào)通路共同調(diào)節(jié)真菌毒素的合成[19-21]。

禾谷鐮刀菌中酸性pH值可誘導(dǎo)真菌毒素DON生物合成酶TRI5基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)DON的生物合成。中性或堿性pH值條件下則不能合成DON，TRI基因的表達(dá)也檢測不到[22-23]。而pH值調(diào)控DON的合成是通過真菌體內(nèi)高度保守的pH值調(diào)控系統(tǒng)完成的。pH值調(diào)控系統(tǒng)的核心為pH值代謝調(diào)節(jié)因子FgPAC1基因(FGSG_12970)，也是轉(zhuǎn)錄因子基因。敲除禾谷鐮刀菌中的FgPAC1基因可增強(qiáng)酸性條件下早期TRI基因的表達(dá)和增加DON生物合成量的積累。且主要的TRI家族調(diào)節(jié)基因TRI6和TRI10基因啟動(dòng)子區(qū)都有潛在的FgPAC1基因的結(jié)合位點(diǎn)5′-GCCAAG-3′[23-24]。因此，在禾谷鐮刀菌中，F(xiàn)gPAC1基因反向調(diào)控TRI家族基因的表達(dá)和DON的生物合成。

表1 DON生物合成中心基因和功能

酵母和絲狀真菌中葡萄糖是優(yōu)先碳源，會(huì)被優(yōu)先吸收利用。只有在環(huán)境中沒有葡萄糖時(shí)，酵母和絲狀真菌才會(huì)使用其他碳源。如果優(yōu)先碳源存在，就會(huì)抑制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，即碳代謝抑制(carbon catabolite repression，簡稱CCR)[25]。禾谷鐮刀菌中，蔗糖能夠強(qiáng)烈誘導(dǎo)TRI4/TRI5基因的表達(dá)和真菌毒素DON的生物合成，但葡萄糖不能。同時(shí)，在蔗糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基中額外加入葡萄糖，不能抑制DON的生物合成，說明CCR沒有參與DON的生物合成[26]。目前，禾谷鐮刀菌中也沒有關(guān)于CCR相關(guān)調(diào)節(jié)基因參與DON生物合成的相關(guān)報(bào)道。

胍基丁胺和精氨酸等氮源可強(qiáng)烈誘導(dǎo)禾谷鐮刀菌中TRI5基因的表達(dá)和真菌毒素DON的生物合成，但在相關(guān)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中額外加入銨態(tài)氮?jiǎng)t能抑制真菌毒素DON的生物合成[27-28]。銨態(tài)氮源是優(yōu)先氮源，因此氮代謝抑制(nitrogen metabolite repression，簡稱NMR)參與了DON的生物合成。禾谷鐮刀菌中氮代謝抑制的調(diào)控中心為調(diào)節(jié)因子FgAREA基因(FGSG_08634)，也是轉(zhuǎn)錄因子基因，在銨態(tài)氮源缺乏時(shí)，F(xiàn)gAREA基因會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá)，使次級(jí)碳源能夠被利用。敲除禾谷鐮刀菌中的FgAREA基因能夠抑制TRI5、TRI6、TRI10基因的表達(dá)，同時(shí)DON生物合成量大幅降低[28-30]。Hou等發(fā)現(xiàn)在禾谷鐮刀菌中，F(xiàn)gAREA基因能夠與TRI10基因直接互作，且主要的TRI家族基因啟動(dòng)子區(qū)都有潛在的FgAREA基因的結(jié)合位點(diǎn)5′-HGATAR-3′(其中H代表A、T、C，R代表A或G)[28]。因此，在禾谷鐮刀菌中，F(xiàn)gAREA基因正向調(diào)控TRI家族基因的表達(dá)和DON的生物合成。參與氮代謝抑制的另一個(gè)調(diào)節(jié)因子FgNMR1基因(FGSG_07197)在銨態(tài)氮源充足時(shí)，能夠抑制FgAREA基因的表達(dá)。但敲除禾谷鐮刀菌中的FgNMR1基因，對(duì)DON生物合成并沒有影響。同時(shí)，Nasmith等發(fā)現(xiàn)禾谷鐮刀菌中TRI6基因也可以通過FgNMR1基因的表達(dá)來調(diào)控FgAREA基因[31]。

低濃度的H2O2能夠刺激禾谷鐮刀菌中真菌毒素DON的生物合成[32]。DON生物合成家族TRI基因的表達(dá)在禾谷鐮刀菌侵染小麥的早期能夠被檢測到[33]，而氧迸發(fā)是植物常見的防衛(wèi)反應(yīng)，因此禾谷鐮刀菌可能是把寄主產(chǎn)生的活性氧作為一個(gè)觸發(fā)器來刺激DON的生物合成，因?yàn)镈ON本身也是重要的植物性毒素和毒力因子[3]。禾谷鐮刀菌中，參與過氧化物壓力調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因?yàn)镕gATF1(FGSG_10142)、FgSKN7(FGSG_06359)、FgYAP1(FGSG_08800)，雖然這3個(gè)基因都起著對(duì)氧分壓容忍的作用，但敲除FgATF1基因并不能夠影響DON的生物合成，敲除FgSKN7基因能夠降低DON生物合成量，而且降低了H2O2對(duì)TRI基因表達(dá)水平的誘導(dǎo)[34]，敲除FgYAP1基因能夠使DON生物合成家族TRI基因表達(dá)量升高，同時(shí)DON生物合成量大幅增加[35]。因此，在禾谷鐮刀菌中，F(xiàn)gSKN7基因正向調(diào)控TRI家族基因的表達(dá)和DON的生物合成，而FgYAP1基因反向調(diào)控TRI家族基因的表達(dá)和DON的生物合成。

禾谷鐮刀菌中，促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，簡稱MAPK)、環(huán)腺苷酸單磷酸-蛋白激酶A(cyclic adenosine phosphate-protein kinase A，簡稱cAMP-PKA)、雷帕霉素(target of rapamycin，簡稱TOR)等信號(hào)通路也都能夠調(diào)控真菌毒素DON的生物合成。MAPK信號(hào)通路能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化和對(duì)環(huán)境的應(yīng)激適應(yīng)等多種重要的病理過程。禾谷鐮刀菌MAPK信號(hào)通路包含3個(gè)磷酸化途徑——Mgv1、Gpmk1、FgHog1磷酸化途徑。Mgv1磷酸化途徑的3個(gè)中心激酶基因[FgBck1(FGSG_06326)、FgMmk2(FGSG_07295)、FgMgv1(FGSG_10313)]被敲除后都會(huì)嚴(yán)重影響禾谷鐮刀菌侵染和產(chǎn)毒，突變體僅在接種點(diǎn)發(fā)病，幾乎檢測不到DON生物合成量[36]。破壞MAPK信號(hào)通路的Gpmk1磷酸化途徑同樣也能夠影響病原菌在小麥穗部的定殖和擴(kuò)展[37]，Gpmk1磷酸化途徑的3個(gè)中心激酶基因[FgSte11(FGSG_05484)、FgSte7(FGSG_09903)、Fgpmk1(FGSG_06385)]被敲除后，DON生物合成量急劇降低[36-37]。FgHog1磷酸化途徑能夠調(diào)控滲透壓調(diào)節(jié)信號(hào)，參與FgHog1磷酸化途徑的中心激酶基因包括FgHOG1(Fg09612)、FgPBS2(Fg08691)、FgSSK2(Fg00408)，這3個(gè)基因的敲除突變體都能夠使DON生物合成量降低[38]。

cAMP-PKA信號(hào)通路能夠調(diào)控真菌的生長發(fā)育和致病機(jī)制[39]，禾谷鐮刀菌中編碼蛋白激酶A催化亞基的為FgCPK1(FGSG_07251)、FgCPK2(FGSG_08729)蛋白激酶基因。敲除FgCPK1基因，禾谷鐮刀菌真菌毒素DON生物合成量降低，但敲除FgCPK2基因，DON生物合成量并沒有明顯變化，敲除禾谷鐮刀菌中腺苷酸環(huán)化酶FgFAC1基因則不能合成DON[40-42]。當(dāng)培養(yǎng)基中加入環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，簡稱cAMP)時(shí)，可以刺激TRI基因表達(dá)來誘導(dǎo)DON生物合成。額外加入cAMP并不能恢復(fù)tri6突變體的表型缺失，但卻能恢復(fù)tri10突變體在DON生物合成中的表型缺陷。cAMP的磷酸二酯酶基因?yàn)镕gPDE1和FgPDE2。敲除FgPDE2基因可以激活蛋白激酶A(protein kinase A，簡稱PKA)的活性并增加DON的生物合成量，F(xiàn)gPDE1基因敲除突變體并沒有此功能。但雙突變體Fgtri6pde2菌株不能檢測到DON，雙突變體Fgtri10pde2菌株DON生物合成量顯著高于tri10單突變體，說明在 cAMP-PKA信號(hào)通路調(diào)節(jié)DON生物合成中，TRI6基因是必需的，同時(shí)，F(xiàn)gPDE2基因反向調(diào)節(jié)DON生物合成[43]。

TOR信號(hào)通路在營養(yǎng)物質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用[44]。但此信號(hào)途徑唯一的激酶基因FgTOR1/2(FGSG_08133)可能為致死基因[36]，與此激酶互作的Tap42磷酸激酶復(fù)合物由3個(gè)基因[FgPP2A(FGSG_09815)、FgSIT4(FGSG_01464)、FgPPG1(FGSG_05281)]編碼。其中，F(xiàn)gPP2A(FGSG_09815)基因不能被敲除，F(xiàn)gSIT4、FgPPG1基因可以被敲除。敲除FgSIT4基因不影響DON生物合成，但敲除FgPPG1基因后突變體中檢測不到DON[45]。

這些信號(hào)通路能夠影響真菌毒素DON生物合成量，說明它們參與調(diào)控了DON的生物合成。調(diào)控機(jī)制可能是唯一的，但絕大多數(shù)信號(hào)通路應(yīng)該是把外界環(huán)境因子的信號(hào)傳導(dǎo)給體內(nèi)的調(diào)控機(jī)制，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)DON生物合成的總體調(diào)控。氮源調(diào)控DON生物合成調(diào)控中心轉(zhuǎn)錄因子FgAreA基因能夠影響Gpmk1的磷酸化水平及cAMP-PKA活性水平[28]。在TOR作用下，參與氮代謝的一些基因可以被誘導(dǎo)表達(dá)。同時(shí)，Audenaert等發(fā)現(xiàn)FgAREA和FgPPG1基因突變體在產(chǎn)孢率、致病性和DON生物合成量的表型方面都基本一致，可能因?yàn)镕gAreA是FgPPG1的下游元件，共同參與了TOR信號(hào)途徑[32]。這些數(shù)據(jù)表明信號(hào)通路和代謝途徑應(yīng)該是相互作用共同調(diào)控DON的生物合成。但目前氮代謝和信號(hào)通路的研究較多，其他代謝途徑的相關(guān)報(bào)道較少。

3 展望

禾谷鐮刀菌真菌毒素DON不僅能夠危害人、畜的健康，還是重要的致病因子，同時(shí)也是防治小麥赤霉病的關(guān)鍵。目前，還沒有關(guān)于控制禾谷鐮刀菌真菌毒素DON合成的有效途徑。傳統(tǒng)防治小麥赤霉病的手段以化學(xué)、物理方法為主，但防效甚微，還可能造成化學(xué)農(nóng)藥污染。我國關(guān)于小麥赤霉病的抗病育種的工作開始的較晚，也沒有培育出較強(qiáng)的抗小麥赤霉病品種。因此，借助基因工程相關(guān)手段進(jìn)行小麥赤霉病的防治極其重要，而搞清小麥赤霉病致病菌禾谷鐮刀菌真菌毒素DON的調(diào)控機(jī)制對(duì)防治小麥赤霉病的擴(kuò)展和毒素的污染起著重要作用?？梢酝ㄟ^控制禾谷鐮刀菌DON調(diào)控機(jī)制中的關(guān)鍵基因和關(guān)鍵信號(hào)通路來抑制禾谷鐮刀菌產(chǎn)生真菌毒素DON，從而控制禾谷鐮刀菌的進(jìn)一步擴(kuò)展，起到防治小麥赤霉病和提高糧食安全的作用。