趙 亮， 狄佳春， 陳旭升

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所/農(nóng)業(yè)部長江下游棉花與油菜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210014

甲基化作用廣泛存在于生物體內(nèi)，由甲基轉(zhuǎn)移酶(methyltransferases，簡稱MTs)依賴S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosine-L-methionine，簡稱SAM)作為甲基供體催化形成相對應(yīng)的甲基化形式產(chǎn)物[1]。在植物次生代謝中甲基化是一個(gè)非常普通的酶修飾反應(yīng)，幾乎所有的植物次生代謝途徑都會(huì)發(fā)生甲基化，例如氨基酸、生物堿、苯丙素類、糖、嘌呤、甾醇類、硫醇類和黃酮類。甲基轉(zhuǎn)移酶可根據(jù)甲基轉(zhuǎn)移到受體分子上不同的原子而分為C、N、S和O位甲基轉(zhuǎn)移酶[2]。

SABATH甲基轉(zhuǎn)移酶是屬于O位甲基轉(zhuǎn)移酶(O-methyltransferase，簡稱OMTs)，該家族催化一些小分子羧基和生物堿的甲基化，這個(gè)家族在最初發(fā)現(xiàn)鑒定的3個(gè)酶的基礎(chǔ)上共同命名為SABATH甲基轉(zhuǎn)移酶(SABATH-MTs)。這3個(gè)酶分別是水楊酸羧基甲基轉(zhuǎn)移酶(salicylic acid carboxyl methyltransferases，簡稱SAMT)、苯甲酸羧基甲基轉(zhuǎn)移酶(benzoic acid carboxyl methyltransferases，簡稱BAMT)和可可堿合酶(theobromine synthase)[3-7]。對SABATHMTs基因序列分析表明，在擬南芥中存在24個(gè)該家族基因成員。功能研究清楚的有茉莉酸羧基甲基轉(zhuǎn)移酶(jasmonic acid carboxyl methyltransferase，簡稱JMT)[8]、苯甲酸/水楊酸羧基甲基轉(zhuǎn)移酶(benzoic/salicylic acid carboxyl methyltransferases，簡稱BSMT)[9]、吲哚乙酸羧基甲基轉(zhuǎn)移酶(indole-acetic acid carboxyl methyltransferase，簡稱IAMT)[10]、法尼烯酸羧基甲基轉(zhuǎn)移酶(farnesoic acid carboxyl methyltransferase，簡稱FAMT)[11]、赤霉素羧基甲基轉(zhuǎn)移酶(gibberellin acid carboxyl methyltransferase，簡稱GAMT)[12]。棉花基因組數(shù)據(jù)的公開發(fā)表，為SABARH-MTs基因家族的全基因組分析提供了便利的條件。本研究利用生物信息學(xué)的方法，從棉花基因組數(shù)據(jù)庫中查找可能的SABATH-MTs基因家族成員，并對這些成員進(jìn)行結(jié)構(gòu)、進(jìn)化及表達(dá)上的分析。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫來源

陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1的基因組數(shù)據(jù)庫來源于http：//mascotton.njau.edu.cn；棉花二倍體D基因組雷蒙德氏棉(G.Raimondii)的基因組數(shù)據(jù)庫來源于http：//www.phytozome.net；棉花二倍體A基因組亞洲棉的基因組數(shù)據(jù)來源于http：//cgp.genomics.org.cn/page/species/index.jsp；擬南芥GAMT基因來源于擬南芥信息資源(the arabidopsis information resource，簡稱TAIR)數(shù)據(jù)庫(http：//www.arabidopsis.org)。

1.2 基因注釋

GAMT注釋根據(jù)Sonnhammer等[13]的方法，HMMER軟件版本為3.0；GAMT種子文件來自于蛋白質(zhì)家族的集合數(shù)據(jù)庫(Pfam數(shù)據(jù)庫，http：//pfam.sanger.ac.uk/)，種子編號(hào)為PF03492。蛋白質(zhì)的氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域的分析采用在線的SMART(http：//smart.embl-heidelberg.de)進(jìn)行檢測。

1.3 序列比對及進(jìn)化樹構(gòu)建

利用MEGA 5.05[14]構(gòu)建進(jìn)化樹，構(gòu)建方法利用最大似然函數(shù)，Bootstrap實(shí)行1 000次重復(fù)。序列比對利用 Clastal 1.83 完成，比對結(jié)果及處理利用GENDOC軟件來完成。

1.4 基因表達(dá)分析

基因表達(dá)分析采用高通量的陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1營養(yǎng)組織(根、莖、葉)、花瓣、花藥及纖維發(fā)育時(shí)期[開花當(dāng)天(0 day post-anthesis，簡稱0 DPA)、開花后10天(10 DPA)、開花后20天(20DPA)]的RNA-seq數(shù)據(jù)庫[15]。基因表達(dá)水平利用Log2(FPKM)的數(shù)值進(jìn)行評估，其結(jié)果利用Cufflinks軟件(http：//cufflinks.cbcb.umd.edu)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組數(shù)據(jù)庫中SABATH-MTs基因的注釋

由于SABATHMTs家族基因的蛋白結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)Methyltransf_7的蛋白結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在Pfam數(shù)據(jù)庫中的種子文件編號(hào)為PF03492。通過HMMER 3.0中的hmmsearch程序及種子文件，在陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1基因組中共查找到37個(gè)基因，其中At亞組中有16個(gè)基因，Dt亞組中有19個(gè)，還有2個(gè)基因的染色體信息不清楚；二倍體D基因組雷蒙德氏棉中查找到22個(gè)基因；二倍體A基因組亞洲棉中查找到24個(gè)基因，這些基因在染色體上呈現(xiàn)不均勻的分布。以陸地棉TM-1為例，在查找到的37個(gè)基因不均勻的分布在19條染色體上，其中9條染色體屬于At亞組，10條染色體屬于Dt亞組；A10、D10和D13上的分布的基因最多，分別預(yù)測到4個(gè)基因(圖1)。

2.2 SABATH-MTs基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

根據(jù)已經(jīng)報(bào)道具有已知功能的SABATH-MTs基因，從美國國立生物技術(shù)信息中心(national center for biotechnology information，簡稱NCBI)上下載其對應(yīng)的蛋白序列與棉花基因組中預(yù)測的基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果表明，在總計(jì)預(yù)測到的83個(gè)基因(四倍體中有37個(gè)；二倍體D組中有22個(gè)；二倍體A組中有24個(gè))中，有34個(gè)基因能夠與已知功能的SABATH-MTs基因聚到同一分支(圖2)。這34個(gè)基因中有8個(gè)基因來自于二倍體A組，9個(gè)基因來自于二倍體D組；17個(gè)基因包括At亞組9個(gè)、Dt亞組8個(gè)。進(jìn)一步分析表明，來源二倍體A組和D組的基因在四倍體中都能夠找到其相應(yīng)的同源基因(表1)。

2.3 SABATH-MTs基因表達(dá)分析

在陸地棉TM-1中預(yù)測到的37個(gè)SABATH-MTs基因在其根、莖、葉、花瓣、花藥及3個(gè)纖維發(fā)育時(shí)期(0、10、20 DPA)的轉(zhuǎn)錄組中的表達(dá)分析表明，共有20個(gè)基因在至少1個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中能夠檢測到表達(dá)[Log2(FPKM)>1]。其中有10個(gè)基因只在1個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中能夠檢測到表達(dá)。Gh_D02G2159、Gh_A10G1598、Gh_A13G0249和Gh_D13G0266只在根的轉(zhuǎn)錄組中檢測到有表達(dá)；只在莖的轉(zhuǎn)錄組中檢測有表達(dá)的為Gh_D13G2235和Gh_D09G0289；Gh_A05G1642在葉的轉(zhuǎn)錄組中?；磉_(dá)；Gh_D10G1851和Gh_D11G1755在花藥的轉(zhuǎn)錄組中?；磉_(dá)；Gh_A01G0661在0 DPA的胚珠中?；磉_(dá)?；ò?、10 DPA和20 DPA的纖維中沒有找到?；磉_(dá)的基因(圖3)。

3 結(jié)論與討論

甲基化在許多生物進(jìn)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的修飾作用，它包括基因和代謝的調(diào)控。在植物中，甲基化也有著廣泛的作用。與其他已知的甲基轉(zhuǎn)移酶比較發(fā)現(xiàn)，SABATH家族在幾個(gè)方面都是獨(dú)特的。首先，除了保守的SAM結(jié)合序列，SABATH-MTs與其他MTs沒有序列的相似性[2]；再者，SABATH基因家族的蛋白能夠催化O位和N位2個(gè)位置的甲基化，而其他的MTs只能執(zhí)行1種類型的甲基化[3，5，7]。擬南芥基因組中包含24個(gè)SABATH家族蛋白成員，其中一些蛋白具有明顯的特征。例如，茉莉酸羧基甲基轉(zhuǎn)移酶(JMT)、苯甲酸嘌呤/水楊酸羧基甲基轉(zhuǎn)移酶(BSMT)、吲哚乙酸甲基轉(zhuǎn)移酶(IAMT)、法尼烯酸羧基甲基轉(zhuǎn)移酶(FAMT)及赤霉素羧基甲基轉(zhuǎn)移酶(GAMT)等[8-9，11-12，16-18]。而根據(jù)生物信息學(xué)的分析，在四倍體陸地棉中預(yù)測了37個(gè)SABATH-MTs家族成員；在二倍體亞洲棉中預(yù)測了24個(gè)；在二倍體雷蒙德氏棉中預(yù)測了22個(gè)。這些家族成員通過進(jìn)化分析，有部分成員能夠與已經(jīng)報(bào)道的具有特定功能的SABATH-MTs基因聚集到同一分支。四倍體陸地棉TM-1中預(yù)測到的37個(gè)基因中，有20個(gè)基因能夠在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中檢測到表達(dá)，另外的17個(gè)基因未能檢測到表達(dá)。這些未能檢測到表達(dá)的基因有可能是以假基因的形式存在于基因組中， 或者在其他組織部位及纖維發(fā)育時(shí)期?；磉_(dá)而未能檢測到。通過進(jìn)化及表達(dá)分析的結(jié)果，為今后對于棉花中SABATH-MTs家族成員的功能研究起到了一定的指導(dǎo)作用。

表1 通過進(jìn)化分析具有特定功能的SABATH-MTs基因