徐小波， 于建寧， 王公金， 譚小東

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所/農(nóng)業(yè)部種養(yǎng)結(jié)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210014

哺乳動物卵泡中的卵母細(xì)胞是一個(gè)初級卵母細(xì)胞，在排卵前不久進(jìn)行第1次減數(shù)分裂，產(chǎn)生1個(gè)次級卵母細(xì)胞，排出1個(gè)第一極體(PbⅠ)。與次級卵母細(xì)胞相比，PbⅠ細(xì)胞質(zhì)很少，但PbⅠ作為一種特殊而又有著完整細(xì)胞功能的細(xì)胞，其生物學(xué)功能和利用價(jià)值亦受到人們重視。極體的生殖功能已經(jīng)被Wakayama等證明[1-2]，小鼠PbⅠ和第二極體(PbⅡ)均能獲得有生殖能力的后代；小鼠PbⅡ和雌原核已被成功冷凍并重組產(chǎn)生后代[3]，但尚未見其他動物極體研究的報(bào)道。

豬卵母細(xì)胞和胚胎冷凍保存相當(dāng)困難，主要原因是豬卵的細(xì)胞質(zhì)中含有較大的脂肪顆粒，在凍融過程中極易造成細(xì)胞破裂，而極體胞質(zhì)很少，冷凍保存相對容易，通過極體重組可有效解決豬母本種質(zhì)資源難以保存的難題[4]。本研究試圖揭示豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)條件下PbⅠ排出規(guī)律、形態(tài)學(xué)以及不同保存條件下存活狀態(tài)等特征，以期為極體核重組豬卵母細(xì)胞等研究提供一定的理論與技術(shù)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 豬卵巢卵母細(xì)胞的采集與成熟培養(yǎng)

從剛屠宰的母豬采集新鮮卵巢，在無菌實(shí)驗(yàn)室及時(shí)用注射器抽吸3～6 mm的卵泡液，于實(shí)體鏡下?lián)烊“恢?～4層顆粒細(xì)胞的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，經(jīng)TCM199預(yù)平衡2 h后，選取形態(tài)正常的COCs，進(jìn)行成熟培養(yǎng)(含5% CO2的空氣，飽和濕度，39 ℃)24～72 h，于倒置顯微鏡下觀察卵丘細(xì)胞擴(kuò)散狀態(tài)。

1.2 PbⅠ的排出、形態(tài)分級和活性鑒定

取不同時(shí)間段體外成熟培養(yǎng)的COCs，在倒置顯微鏡下用顯微操作針撥動卵母細(xì)胞，觀察PbⅠ的排出情況，并進(jìn)行極體形態(tài)學(xué)分級統(tǒng)計(jì)和活性鑒定。PbⅠ的形態(tài)學(xué)評估標(biāo)準(zhǔn)參照Ebner等的方法[5]進(jìn)行，PbⅠ活性鑒定參照劉文華等的方法[6]進(jìn)行。

1.3 PbⅠ的保存方法

1.3.1 常溫及低溫保存 去除卵丘細(xì)胞后，卵母細(xì)胞在TCM199改良培養(yǎng)液中清洗3次，根據(jù)形態(tài)分類選取含1～2級PbⅠ的卵母細(xì)胞移入預(yù)平衡的培養(yǎng)液微滴中，分別在4～10 ℃及39 ℃ 2種溫度條件下培養(yǎng)，每隔一段時(shí)間取部分卵母細(xì)胞染色，對其PbⅠ進(jìn)行活性鑒定。

1.3.2 冷凍和超低溫冷凍保存 將含1～2級PbⅠ的卵母細(xì)胞移入EG20冷凍液中，平衡7 min；再移至EG40冷凍液并裝入直徑200～300 μm的微管中；裝管完成后，分別立即置于冰箱-20 ℃冰室和直接投入液氮(-196 ℃)冷凍保存。每隔一段時(shí)間，取樣解凍，進(jìn)行PbⅠ活性鑒定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

PbⅠ的排出率、形態(tài)正常率及存活率等采用SPSS 11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同體外成熟培養(yǎng)時(shí)間下的PbⅠ排出率

由表1可見，在卵母細(xì)胞數(shù)體外成熟培養(yǎng)過程中，卵丘細(xì)胞逐漸擴(kuò)散，在培養(yǎng)32～36 h后開始排出PbⅠ，培養(yǎng)40 h擴(kuò)散率最高，PbⅠ排出率也達(dá)到最高，為66.7%；隨著培養(yǎng)時(shí)間的繼續(xù)延長，卵丘細(xì)胞慢慢脫落，擴(kuò)散率降低，PbⅠ的排出率逐步下降。

表1 不同體外成熟培養(yǎng)時(shí)間下的PbⅠ排出率

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。表2同。

2.2 不同體外成熟培養(yǎng)時(shí)間下PbⅠ的形態(tài)和活性

卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)32～36 h間開始有PbⅠ排出，且發(fā)現(xiàn)開始排出的PbⅠ中1～2級比例不高。而培養(yǎng)40～44 h 排出的PbⅠ的形態(tài)質(zhì)量較高，其中培養(yǎng)40 h的1～2級比例高達(dá)51.7%，3級占30.7%，4級和5級只有17.6%。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，PbⅠ的形態(tài)完整率明顯降低，到52 h時(shí)1級和2級PbⅠ比例只有14.8%(表2)。通過形態(tài)分級與活性鑒定結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，1～2級PbⅠ大多具有生物活性，3級以下的活性較差。

表2 不同體外成熟培養(yǎng)時(shí)間下的PbⅠ形態(tài)分級

2.3 不同保存溫度下PbⅠ的形態(tài)和活性

由表3可見，39 ℃條件保存2 h，PbⅠ的形態(tài)正常且活性良好，保存4 h形態(tài)尚正常，但活性顯著下降，保存6 h形態(tài)開始不正常，且活性基本喪失；4 ℃條件保存20～40 h期間，形態(tài)完整率差異不顯著，存活率差異顯著，PbⅠ仍然保持良好的形態(tài)和活性，但保存60 h時(shí)，細(xì)胞已崩解或消失，完全喪失活性；-20 ℃冷凍保存1周，多數(shù)PbⅠ形態(tài)完整有活性，保存2～4周形態(tài)完整率與活性均呈現(xiàn)顯著下降趨勢；-196 ℃超低溫冷凍保存后，極體形態(tài)完整率為97.8%，存活率為 89.1%，均保持在較高水平。

表3 不同保存溫度下PbⅠ的存活率和形態(tài)完整率

注：相同溫度不同保存時(shí)間處理數(shù)據(jù)后標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 討論

PbⅠ的排出時(shí)間因物種不同有較大差異。從屠宰場摘取的牛卵巣卵母細(xì)胞大多在體外培養(yǎng)16～24 h開始排出PbⅠ[6]；注射絨促性素(HCG)后12 h小鼠排出卵母細(xì)胞，這是PbⅠ排出的高峰時(shí)段[7]；本試驗(yàn)中豬卵巣卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)32～36 h開始排出PbⅠ，40 h PbⅠ排出率達(dá)66.7%。伴隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長，部分卵母細(xì)胞出現(xiàn)退化現(xiàn)象，卵周隙明顯增大，超大或超小PbⅠ增多。由于從卵巣吸取的卵母細(xì)胞本身成熟度不一致，可以認(rèn)為通過嚴(yán)格選擇卵泡大小和卵母細(xì)胞的成熟度，并改善與控制體外培養(yǎng)條件，可望進(jìn)一步提高卵母細(xì)胞成熟的同步性，在體外培養(yǎng)40～44 h時(shí)或其他時(shí)段能獲得更多優(yōu)質(zhì)的PbⅠ。

Choi等在小鼠上發(fā)現(xiàn)Mos/MAPK基因調(diào)控著PbⅠ的大小、活性、退化與生物學(xué)功能[8]。在本試驗(yàn)中，39 ℃條件下保存時(shí)，豬PbⅠ很快退化致使活性喪失；在4 ℃低溫和-20 ℃條件下，PbⅠ存活時(shí)間則較長；在-196 ℃超低溫條件下保存，能更好地保持PbⅠ的活性?？梢酝茢?，低溫和超低溫可有效降低基因的調(diào)控作用，延緩PbⅠ凋亡進(jìn)程。