張 敏， 顧 勇， 張永輝， 趙錦超， 彭 勇， 徐傳濤， 謝 強， 夏建華， 張軍杰， 魯黎明

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，四川成都 611130； 2.四川省煙草公司瀘州市公司，四川瀘州 646000

多酚類物質(zhì)是植物重要的次生代謝物質(zhì)之一，主要由苯丙氨酸代謝途徑合成。苯丙氨酸代謝主要包括苯丙烷代謝和類黃酮合成2個途徑，其中，苯丙氨酸解氨酶(L-phenylalanine ammonia-lyase，PAL)在苯丙烷類化合物代謝中具有中心酶的作用，可以催化L-苯丙氨酸分子脫氨生成反式肉桂酸反應(yīng)[1]。煙草的PAL由2～4個獨立基因編碼[2]，其基因的表達受外界環(huán)境的影響較大。在正常生長情況下，煙草PAL基因表達較弱；而當(dāng)遭受外界環(huán)境脅迫時，PAL基因會增強表達[3]。研究表明，在感染煙草病毒時，煙株中的PAL基因的表達量顯著增高[4]。用茉莉酸甲酯(MJ)處理煙草時，煙草幼苗的PAL活性明顯提高，其抗病性明顯增強[5]。

肉桂酸-4-羥化酶(cinnamate-4-hydroxylase，C4H)是細(xì)胞色素P450單加氧酶中的一種，在苯丙烷類代謝途徑中同樣具有關(guān)鍵作用，是該途徑中的第2個關(guān)鍵酶[6]。C4H是植物中分布最廣的主要P450之一，在植物各部位都有很高活性。該酶活性的高低，也影響著植物多酚類物質(zhì)的合成。楊慧芹等研究表明，干旱和低溫脅迫下，煙草中C4H的活性和基因表達量與總酚和木質(zhì)素含量的變化趨勢一致[3]。而在煙草C4H的表達受干擾時，煙草木質(zhì)素的含量就會降低[7]。

煙草中的多酚物質(zhì)種類和數(shù)量較多，一般來說，以綠原酸和蕓香苷居主要地位。這些多酚類物質(zhì)，除了在煙草的防御反應(yīng)中發(fā)揮重要作用外，亦是香氣物質(zhì)的重要成分之一[8]。植物多酚類化合物降解所生成的物質(zhì)，能賦予煙草制品典雅的香氣，并增強其香氣品質(zhì)，極大地影響著烤煙的感官質(zhì)量[9-11]。

盡管多酚類物質(zhì)對烤煙的生長發(fā)育及品質(zhì)影響巨大，然而，目前的研究主要集中在酚類物質(zhì)含量的區(qū)域差異分析方面，缺少從基因表達的角度對苯丙烷代謝關(guān)鍵基因的表達與酚類物質(zhì)含量之間關(guān)系進行探尋的研究[12]。因此，本研究以四川各個烤煙產(chǎn)區(qū)烤煙為研究對象，分析煙葉的多酚含量與PAL及C4H基因的相對表達量之間的關(guān)系，以期為烤煙酚類物質(zhì)代謝的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與地點

本研究試驗材料為烤煙品種云煙87和紅花大金元(以下簡稱紅大)。試驗于2015年在四川省6個具有代表性的烤煙生產(chǎn)縣進行，試驗點具體位于攀西地區(qū)的冕寧縣回龍鄉(xiāng)新堡子村、西昌市黃水鎮(zhèn)雙龍村、會理縣南閣鄉(xiāng)南山村、仁和區(qū)平地鎮(zhèn)大村、米易縣普威鎮(zhèn)街村、川南地區(qū)的古藺縣觀文鎮(zhèn)小屯村。

1.2 主要儀器和試劑

主要儀器包括上海佑科公司的UV755B紫外分光光度計、CT15RT臺式高速冷凍離心機、BIO-BAD S1000 PCR儀、BIO-BAD電泳儀、BIO-BAD成像儀、Agilent公司1100高效液相色譜儀、SPD-10AVP紫外檢測器、烘箱等。

主要試劑：硼酸、鹽酸、巰基乙醇、EDTA、抗壞血酸鈉等均為國產(chǎn)分析純；RNA提取用Trizol試劑盒等均購買于寶生物工程(大連)有限公司；反轉(zhuǎn)錄用Fermentas公司的RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 鮮煙葉及烤后煙葉的采集 試驗選取土地平整、灌排方便的地塊。試驗地面積為667 m2，平均分為2塊，分別種植云煙87與紅大。試驗地?zé)熑~的栽培管理按當(dāng)?shù)氐膬?yōu)質(zhì)煙葉栽培規(guī)程進行。試驗所選取的煙樣分為鮮樣和干樣，其中鮮樣在烤煙旺長期、打頂期和成熟期進行采集，干樣為烤后煙葉樣品，在煙葉調(diào)制后采集。

鮮樣采集：在烤煙各生育期時期，于晴朗天氣上午按“S”形取樣方法，選取30株長勢基本一致無病蟲害正常煙株，采集中部煙葉(從下往上數(shù)第10張煙葉)。將采集后的煙葉迅速沿主脈分開，一半在液氮中速凍，帶回實驗室后凍存于-80 ℃ 冰箱，用于基因表達水平測定；另一半先于105 ℃殺青30 min，然后于60 ℃烘箱中烘干，粉碎后過40目篩，用于多酚類物質(zhì)的測定。

干樣采集：在各試驗點采集烤后煙葉中的C3F等級煙葉各1 kg，于40 ℃烘箱中烘干，粉碎后過40目篩備用。

1.3.2 多酚類物質(zhì)的測定 采用福林法測定待測煙葉樣品中的酚類物質(zhì)，具體參照王瑞新等的方法[13]進行。

1.3.3PAL及C4H基因表達量的檢測 采用實時熒光定量核酸擴增檢測系統(tǒng)(real-time quantitative PCR detecting system，簡稱qPCR)的方法檢測各待測樣品中的PAL及C4H基因相對表達量。樣品總RNA的提取通過Trizol法進行，具體參見魯黎明等的方法[14]進行。cDNA第1條鏈的合成，按照Fermentas公司的RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis試劑盒的操作說明進行。引物設(shè)計及PCR擴增：引物的設(shè)計，參考美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)GeneBank數(shù)據(jù)庫中苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羥化酶(C4H)的基因CDS序列進行。所設(shè)計的引物序列見表1。

表1 qRT-PCR擴增所用引物序列

qPCR擴增：以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，加入表1中的相應(yīng)引物及其他反應(yīng)試劑進行qPCR擴增。反應(yīng)體系：2×SYBR Premix ExTaqⅡ5 μL、上下游引物(10 μmol/L)各 0.5 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 2 μL，總體積10 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s、50 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)區(qū)煙葉多酚含量的比較

酚類物質(zhì)是煙草中重要的次生代謝產(chǎn)物，同時，煙葉中酚類物質(zhì)的含量對烤后煙葉的外觀質(zhì)量和香吃味均有著良好的影響。本研究對烤煙不同生長階段及烤后煙葉的多酚含量進行了分析，結(jié)果見表2。由表2可知，對同一烤煙品種而言，其煙葉中多酚的含量隨著生育進程的遞進而增加。在成熟后期，煙葉中的多酚物質(zhì)積累較快，烤后煙葉中多酚的含量達到最高。同一地區(qū)不同烤煙品種的多酚含量不同，其基本趨勢為紅大高于云煙87。這種趨勢在各個生育時期均表現(xiàn)相同，尤其在烤后煙葉中，紅大的多酚含量遠(yuǎn)高于云煙87。一般認(rèn)為，紅大的香氣質(zhì)與香氣量均好于云煙87，從本研究結(jié)果來看，紅大的多酚含量較高，可能是其中的原因之一。無論在旺長期、現(xiàn)蕾期、成熟期還是在烤后煙葉中，同一品種烤煙在不同地區(qū)中多酚總量存在顯著性差異。對于烤后煙草而言，云煙87煙葉多酚含量最高的地區(qū)為冕寧，最低的為古藺；而紅大煙葉中多酚含量最高的地區(qū)為米易，最低的為會理。

表2 四川烤煙不同品種不同生育期煙葉多酚含量比較

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。表3、表4同。

2.2 不同產(chǎn)區(qū)不同生育期煙葉PAL、C4H基因的相對表達量

烤煙苯丙氨酸解氨酶(PAL)與肉桂酸-4-羥化酶(C4H)是多酚類物質(zhì)合成的2個關(guān)鍵酶。因此，分析它們在不同品種及不同生育期的基因表達情況，對于理解煙葉中多酚類物質(zhì)的含量差異至關(guān)重要。由表3、表4可知，PAL、C4H基因的相對表達量在各個生長期都存在明顯不同。對PAL基因而言，同一品種烤煙其相對表達量總體隨著生育進程的增加呈現(xiàn)下降趨勢，到成熟期達到最低。同一品種不同地區(qū)間，PAL基因的相對表達量差異顯著，但地區(qū)間表現(xiàn)的規(guī)律性并不強。紅大成熟期PAL基因表達較高的地區(qū)為古藺、會理及米易，與這些地區(qū)煙葉中的多酚含量較高(表2)相呼應(yīng)。此外，就紅大與云煙87品種來看，在成熟期，古藺、西昌、會理紅大的PAL基因表達量相對較高。

表3 四川烤煙品種與地區(qū)間PAL基因相對表達量差異

表4 四川烤煙品種與地區(qū)間C4H基因相對表達量差異

肉桂酸-4-羥化酶(C4H)是多酚代謝中第2個關(guān)鍵酶，C4H基因在不同地區(qū)、不同品種及不同生育期的相對表達量見表4?？傮w來看，C4H在不同品種、不同地區(qū)的各時期表達量都存在很大差異，趨勢表現(xiàn)沒有明顯的規(guī)律性。同一地區(qū)不同品種間，成熟期煙葉中的C4H基因表達量有較大的差異。就紅大而言，古藺、冕寧、西昌、米易4地?zé)熑~中C4H基因的表達量相對較高，與這4地中烤后煙葉的多酚含量較高較為吻合。對云煙87來說，C4H基因在古藺和米易2個地區(qū)相對表達量比較低，而在冕寧和會理2個地區(qū)相對表達量較高。從多酚含量分析的結(jié)果來看(表2)，冕寧和會理2個地區(qū)煙葉的多酚類物質(zhì)含量高，而古藺與米易2個地區(qū)煙葉的多酚類物質(zhì)含量就相對較低。這說明C4H基因的相對表達量也與烤后煙葉中多酚類物質(zhì)的含量密切相關(guān)。

基因相對表達量分析結(jié)果表明，基因表達的不同可能會影響到相應(yīng)酶變化，并最終將使得該代謝途徑代謝產(chǎn)物的變化，從而導(dǎo)致煙葉中多酚含量的不同。

2.3 PAL及C4H基因表達量與煙葉中多酚含量的相關(guān)性分析

采用qRT-PCR的方法，測定烤煙旺長期、現(xiàn)蕾期及成熟期的PAL及C4H的基因表達量，并將其與烤后煙葉的多酚含量進行相關(guān)性分析。由表5可知，總體來看，烤后煙葉中多酚的含量與PAL及C4H基因在成熟期的表達量密切相關(guān)。對PAL基因而言，云煙87相關(guān)性在成熟期達顯著水平；紅大在各個時期的相關(guān)性均不顯著，甚至呈負(fù)相關(guān)。C4H的相關(guān)性表現(xiàn)明顯，成熟期2個品種的相關(guān)性均達極顯著水平；旺長期云煙87的表達量與多酚含量呈顯著正相關(guān)，現(xiàn)蕾期紅大則呈顯著負(fù)相關(guān)。由此說明，煙葉成熟期PAL、C4H基因的表達量與烤后煙葉的多酚含量有著十分緊密的聯(lián)系，可能是決定煙葉多酚含量的關(guān)鍵時期。

表5 烤后煙葉多酚含量與PAL、C4H基因表達量的相關(guān)性

注：“*”“**”分別表示基因表達量與烤后煙葉中多酚含量顯著相關(guān)、極顯著相關(guān)。

3 討論與結(jié)論

本研究分析了烤后煙葉中多酚含量與PAL、C4H基因表達量的關(guān)系，結(jié)果表明，這2個基因在煙葉成熟期的表達量與多酚含量密切相關(guān)。

多酚類物質(zhì)是植物的一種重要的次生代謝物質(zhì)，在植物的生長發(fā)育及抵御逆境方面發(fā)揮著十分重要的作用[9-10]。對于煙草而言，多酚類化合物與煙葉品質(zhì)有密切關(guān)系，也是煙草品質(zhì)高低的衡量指標(biāo)之一[11]。煙草中的多酚類物質(zhì)主要通過酶促反應(yīng)、棕色化反應(yīng)等影響煙氣生理強度、煙葉色澤和香味[15]。煙草多酚主要包括蕓香苷與綠原酸，其中，綠原酸是一種二羧酯，本身具有弱的清香味[16-17]，經(jīng)過酶促反應(yīng)可以生成吡咯、吡啶、吡嗪類物質(zhì)，這些物質(zhì)對煙葉的色澤和香味均有重要的作用[11]。同時，烤煙調(diào)制過程中所發(fā)生的棕色化反應(yīng)直接影響了煙葉的顏色[9]。此外，煙草燃燒時，多酸類化合物發(fā)生酸性反應(yīng)可以中和堿類，使得煙草吸味醇和[15]。

多酚類物質(zhì)由苯丙烷代謝途徑產(chǎn)生，PAL、C4H、4CL是該合成代謝途徑中的關(guān)鍵酶[13]。煙草的PAL由2～4個獨立基因編碼[2]。肉桂酸羥化酶是植物中分布最廣的主要P450之一，C4H的顯著特點是在植物各部位都有很高活性。肉桂酸羥化酶是第1個被鑒定的植物P450單加氧酶[18]，也是第1個既被克隆又確定了功能的植物P450。迄今，許多植物的C4H基因已被分離[19]。如駱萍等研究參與棉酚合成的P450單加氧酶時，就分離得到2個C4H同源cDNA克隆CYP73A25、CYP73A26[20]。

研究表明，PAL、C4H、4CL等基因表達量的高低，除了與煙草的生長發(fā)育有關(guān)外，還與烤煙抵御不良環(huán)境密切相關(guān)[4-5，7，12，21]。本研究中，煙草的多酚隨著生育進程而逐漸積累，到成熟期達到最高。同時，PAL、C4H的表達量在不同生育期也不同。相關(guān)性分析的結(jié)果表明，煙草多酚的含量與成熟期PAL、C4H的表達量有著十分緊密的聯(lián)系。Williamson等研究表明，PAL、C4H、4CL等基因表達量高的品種，其當(dāng)代及后代的多酚含量也高[21]。本研究的結(jié)果既印證了Williamson等的結(jié)果，又做了進一步的補充，即成熟期PAL、C4H的表達量才是決定煙葉中的多酚含量高低的關(guān)鍵因素。

此外，本研究的結(jié)果還說明，不同烤煙品種的PAL、C4H的表達模式并不相同。如PAL的表達量與烤后煙葉的煙堿含量呈負(fù)相關(guān)，而C4H的表達量與煙堿含量則呈正相關(guān)。其中的原因是否與PAL、C4H在苯丙烷代謝途徑中的作用有關(guān)，尚有待于研究。

烤煙是我國重要的經(jīng)濟作物。多酚類化合物及其分解產(chǎn)物與煙草的等級及香味有關(guān)，是煙草的一種重要品質(zhì)標(biāo)志物。因此，未來的研究應(yīng)從分子生物學(xué)的角度，對編碼苯丙烷代謝途徑中關(guān)鍵酶的基因的功能進行深入的研究，明確其在苯丙烷代謝調(diào)控中的作用，以為進一步調(diào)控?zé)煵荻喾游镔|(zhì)的合成以及提高煙草的品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。