宋立立， 頓寶慶， 張亞楠， 張兆英

(1.滄州師范學院生命科學學院，河北滄州 061000；2.中國農(nóng)業(yè)科學研究院作物科學研究所/國家農(nóng)作物基因資源與基因改良重大科學工程/生物質(zhì)能源研究中心，北京 100081

在釀酒行業(yè)中，作為原料的糧食外層有纖維素和木聚糖等半纖維素成分，從而影響對淀粉的利用率。利用木聚糖酶作用于半纖維素層，降低物料黏度，有利于提高淀粉的利用率，增加乙醇的產(chǎn)率[1]。木聚糖酶通過水解木糖分子1，4-糖苷鍵，將木聚糖水解為木寡糖等低木聚糖及少量木糖和阿拉伯糖，在食品、飼料、醫(yī)藥、能源、生物轉(zhuǎn)化等行業(yè)中有著廣泛的應用[2-4]。果膠酶是可將果膠協(xié)同分解為半乳糖醛酸等小分子的一組酶的總稱，存在于高等植物及微生物中，也分布在某些昆蟲和原生動物中。根據(jù)果膠酶作用原理分為原果膠酶、果膠酯酶、水解酶、裂解酶[5]，其中水解酶和裂解酶統(tǒng)稱解聚酶。果膠裂解酶在果酒的澄清和提高出酒率方面起著重要作用[6]。

近年來，蛋白融合技術越來越受到人們的關注，其中基因重疊延伸技術應用最為廣泛，通過重疊PCR方法將木聚糖酶基因和果膠裂解酶基因連接在一起，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21原核系統(tǒng)中，實現(xiàn)了木聚糖酶-果膠裂解酶雙功能酶的分泌表達，為工業(yè)化應用奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

海棲熱袍桿菌購自中國農(nóng)業(yè)科學院微生物菌種保藏中心；木聚糖酶基因來源菌桔青霉CR-2由筆者所在實驗室篩選得到；pPAL7表達載體購自BIO-RAD(美國)公司；表達菌株BL21和克隆宿主菌EscherichiacoliDH5α由筆者所在實驗室保存。限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶均購自NEB(北京)有限公司；PGEM-Teasy購自Promega(北京)生物技術有限公司；DNA回收試劑盒和DNA純化試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；氨芐青霉素購自Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。試驗涉及引物見表1。

表1 試驗涉及引物

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 LB培養(yǎng)基配制方法參照《分子克隆實驗指南》[7]。

1.2.2 目的基因片段的克隆 用P1和P2、P3和P4分別對2個基因做PCR擴增，將擴增得到的片段電泳檢測，條帶正確的1組將2個基因PCR組分混合，用兩端引物P1和P4做融合PCR擴增，最終得到融合基因序列，擴增物理圖譜如圖1所示。

1.2.3 質(zhì)粒提取方法 質(zhì)粒提取方法參照試劑盒說明書進行操作。

1.2.4 大腸桿菌轉(zhuǎn)化DH5α采用熱擊轉(zhuǎn)化方法參照《分子克隆實驗指南》[7]進行操作。

1.2.5 表達載體質(zhì)粒DNA酶切鑒定 酶切反應體系(μL)：Plasmid DNA 2 μL，10×enzyme buffer 5 μL，NdeⅠ 0.5 μL，EcoRⅠ 0.5 μL，補充ddH2O至20 μL，37 ℃過夜酶切，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.6 目的片度和載體連接 目的片度和pGEM-T easy連接體系：目的片段4 μL，pGEM-T easy 0.5 μL，2×buffer 5 μL，Ligese 0.5 μL，總體積10 μL，漩渦混勻離心機點離，4 ℃ 過夜連接。

1.2.7 大腸桿菌DH5α、BL21的制備 制備方法參照《分子克隆實驗指南》[7]進行操作。

1.2.8 融合基因表達載體的構建 pPAL7表達載體構建方法詳見圖2。

1.2.9 大腸桿菌的誘導表達試驗 挑選驗證正確的單菌落，接入10 mL含100 mg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37 ℃培養(yǎng)至D600 nm為0.2～0.6；取100 μL樣品加入50 mL含 100 mg/mL 氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37 ℃培養(yǎng)至D600 nm為0.2～0.6，加入終濃度達到0.8 mmol/L 的IPTG，37 ℃培養(yǎng)，每 2 h 取樣；樣品超生波破碎后測定其酶活性，分析表達情況。

2 結果與分析

2.1 融合基因的PCR擴增

將來源于海棲熱袍桿菌的果膠裂解酶基因和來源于桔青霉CR-2的木聚糖酶基因分別做PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒純化后等體積混勻，用兩端的引物(P1和P4)做PCR擴增得到融合基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠鑒定，在 1 737 bp 處有1條明顯的條帶，與2個基因的總長度相同(圖3)?；厥誔CR產(chǎn)物連接PGEM-T easy測序，測序結果表明，該基因序列中含有果膠裂解酶基因和木聚糖酶基因，提取重組子的質(zhì)粒雙酶切驗證，驗證后得到2條條帶：一條帶為 1 737 bp，與PCR產(chǎn)物帶相同；另一條帶為3 000 bp，與載體pEGM-T easy的條帶大小一致(圖4)，結果表明融合基因插入載體的位置正確。

2.2 表達載體的構建

雙酶切后回收載體大片段與目的基因連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，得到的重組子提取質(zhì)粒進行雙酶切驗證，酶切結果表明，該重組子中含有該融合基因(圖5)。將該重組子轉(zhuǎn)入受體菌株BL21中進行誘導表達試驗。

2.3 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達

將含有融合基因的重組子進行IPTG誘導，間隔時間取樣，采用DNS法[8]測定其酶活性。果膠裂解酶和木聚糖酶的活性均在誘導6 h時達到最高，分別為30.11 U/mL、2.03 IU/mL(圖6、圖7)。

3 結論

將來源于海棲熱袍桿菌的果膠裂解酶基因和來源于桔青酶的木聚糖酶基因構建融合基因，轉(zhuǎn)化受體菌BL21，經(jīng)IPTG誘導，2個基因?qū)崿F(xiàn)了在大腸桿菌中的共表達。本研究所構建的基因工程菌所產(chǎn)的木聚糖酶的反應溫度為50 ℃，pH值為中性，有比較穩(wěn)定的活性，誘導6 h時酶活性能達到最高，為2.03 IU/mL；果膠裂解酶基因在誘導6 h后酶活性最高達到30.11 U/mL。

本研究果膠裂解酶基因和木聚糖酶基因均比其他文獻中單個基因的表達量低，其原因可在今后的工作中繼續(xù)研究。