李曉慧， 梁 慎， 常高正， 徐小利， 康利允， 高寧寧， 趙衛(wèi)星

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，河南鄭州 450002

西瓜枯萎病是一種世界性瓜類土傳病害[1-2]，由尖孢鐮刀菌西瓜專化型病原菌(Fusariumoxysporumf.sp.niveum)引起，對(duì)西瓜產(chǎn)量和品質(zhì)構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅，是西瓜生產(chǎn)上的主要病害，而且連作加重了枯萎病的發(fā)生，嚴(yán)重影響了西瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)[3]。由于該病原菌可以形成厚垣孢子以抵御外來(lái)侵害，目前尚缺乏安全有效的化學(xué)手段來(lái)防治該病害[4]。選育抗病品種是防治西瓜枯萎病最經(jīng)濟(jì)有效的方法[5]，雖然目前還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)具有高度抗病性的品種用于防治西瓜枯萎病，但尋找抗源仍是育種學(xué)家和植物病理學(xué)家的重要工作目標(biāo)。近年來(lái)，有關(guān)西瓜枯萎病抗性鑒定的研究多集中在枯萎病病菌生理小種鑒定、接種方法、不同品種抗病性的篩選等方面[6-9]，而關(guān)于室內(nèi)快速鑒定技術(shù)方面的系統(tǒng)研究鮮有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)對(duì)影響枯萎病苗期鑒定的接種方法、接種濃度、栽培土質(zhì)、培養(yǎng)容器等進(jìn)行系統(tǒng)篩選與比較，并對(duì)現(xiàn)有的部分西瓜材料進(jìn)行抗性篩選，以期建立一套快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、實(shí)用的西瓜枯萎病苗期抗性鑒定技術(shù)體系，篩選出抗枯萎病的種質(zhì)資源，為西瓜抗枯萎病育種技術(shù)研究提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試抗性鑒定西瓜品種為F365，是感病品種，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所提供。供試西瓜種質(zhì)材料為40份不同來(lái)源的西瓜自交系材料，均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所西甜瓜課題組提供。供試病原菌材料為西瓜枯萎病病菌1號(hào)生理小種，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所西甜瓜課題組保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 分生孢子培養(yǎng)及其孢子液制備 試驗(yàn)于2015年在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato deatrose agar，簡(jiǎn)稱PDA)培養(yǎng)基(配方：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，20 g瓊脂，1 000 mL自來(lái)水)平板上接種西瓜枯萎病病菌1號(hào)生理小種，在28 ℃條件下培養(yǎng)15 d，制備分生孢子液，通過(guò)顯微鏡和血球計(jì)數(shù)板觀察和計(jì)算，配制成分生孢子濃度分別為102、103、104、105、106、107個(gè)/mL 的孢子液備用。

1.2.2 抗病性鑒定方法的篩選 接種方法：(1)傷根灌根法，在子葉展平時(shí)，將西瓜幼苗剪去部分側(cè)根，栽種到培養(yǎng)瓶中，加入適量無(wú)菌水和30 mL分生孢子濃度為105個(gè)/mL的孢子液；(2)直接灌根法：在子葉展平時(shí)，將洗凈的西瓜苗栽種到培養(yǎng)瓶中，加入適量無(wú)菌水和30 mL分生孢子濃度為105個(gè)/mL的孢子液；(3)傷根蘸孢法：在子葉展平時(shí)，將西瓜幼苗剪去部分側(cè)根，浸入分生孢子濃度為105個(gè)/mL的孢子液中 10 min，然后栽種到培養(yǎng)瓶中，加適量無(wú)菌水；(4)土壤拌菌法，將30 mL分生孢子濃度為105個(gè)/mL的孢子液與基質(zhì)混勻，放入培養(yǎng)瓶中，在子葉展平時(shí)，移栽西瓜幼苗。

接種濃度：設(shè)計(jì)分生孢子102、103、104、105、106、107個(gè)/mL 等6個(gè)濃度進(jìn)行接種處理。

栽培土質(zhì)：分別以在121 ℃條件下滅菌60 min后的草炭土、高產(chǎn)土(常年種植蔬菜的大田土壤)、低產(chǎn)土(未種植過(guò)農(nóng)作物的土壤)、珍珠巖等為基質(zhì)，移栽西瓜幼苗。

培養(yǎng)容器：采用經(jīng)高壓滅菌后的培養(yǎng)皿(直徑為150 mm，高度為 20 mm)、營(yíng)養(yǎng)缽(直徑為10 cm，高度為10 cm)、組織培養(yǎng)瓶(底面積為78 cm2，高度為15 cm)進(jìn)行幼苗培養(yǎng)。

除各項(xiàng)單因子研究按照設(shè)計(jì)的方法進(jìn)行外，其余均按以下方法進(jìn)行：采用傷根蘸孢法進(jìn)行接種，分生孢子接種濃度為 105個(gè)/mL，定植于裝有經(jīng)過(guò)滅菌的草炭土的培養(yǎng)瓶中，放在25～28 ℃ 條件下培養(yǎng)，所有處理均設(shè)3次重復(fù)，每次重復(fù)30株苗，接種20 d后觀察并記錄西瓜枯萎病的發(fā)生率。

1.2.3 西瓜種質(zhì)資源抗枯萎病鑒定 采用本研究建立的西瓜枯萎病苗期抗性鑒定技術(shù)對(duì)40份西瓜育種材料進(jìn)行人工接種抗病性鑒定。每個(gè)處理均設(shè)3次重復(fù)，每次重復(fù)30株苗。接種20 d后觀察并記錄西瓜幼苗枯萎病發(fā)生情況，按下列公式計(jì)算枯萎病的病情指數(shù)(DI)：

病情指數(shù)=100×∑(各級(jí)病株數(shù)×各級(jí)代表值)/(調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)代表值)。

病級(jí)分類方法參照文獻(xiàn)[10]，0級(jí)：無(wú)癥狀；1級(jí)：晴天中午子葉萎蔫或部分子葉、真葉輕微萎蔫，夜間能恢復(fù)；2級(jí)：1個(gè)真葉萎蔫或子葉萎蔫較嚴(yán)重；3級(jí)：子葉及60%以上真葉萎蔫，阻礙發(fā)育；4級(jí)：整株萎蔫，60%以上植株枯死，心葉成活；5級(jí)：植株嚴(yán)重萎蔫并枯死。

抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[11]，高抗(HR)：DI≤10；抗病(R)：1070。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗病性鑒定方法篩選

2.1.1 不同接種方法對(duì)病菌致病性影響 由圖1可知，傷根蘸孢法接種導(dǎo)致西瓜枯萎病發(fā)病快，接種20 d后發(fā)病率為76.7%，土壤拌菌法接種效果次之，接種20 d后發(fā)病率為 66.7%；而其他2種接種方法(直接灌根法和傷根灌根法)發(fā)病較緩慢且輕，接種20 d后發(fā)病率均低于20%。表明4種接種方法均能導(dǎo)致西瓜枯萎病的發(fā)生，但傷根蘸孢法接種發(fā)病迅速、均勻，可大大縮短西瓜枯萎病的病程，這可能與該接種方法可使病原菌與西瓜根系直接接觸有關(guān)。

2.1.2 不同土質(zhì)對(duì)病菌致病性影響 由圖2可知，利用草炭土、高產(chǎn)土作為栽培土質(zhì)，西瓜幼苗枯萎病的發(fā)病率較高，分別為86.7%、76.7%，均顯著高于以低產(chǎn)土、珍珠巖作為栽培土質(zhì)時(shí)的枯萎病發(fā)病率。由些可見(jiàn)，土壤肥力越大，發(fā)病越嚴(yán)重，其原因可能是草炭土、高產(chǎn)土的肥力較高，能提供病原菌用以繁殖的能量，進(jìn)而加快對(duì)西瓜幼苗的侵染。因此，在試驗(yàn)中，為使西瓜幼苗準(zhǔn)確快速發(fā)病，建議采用草炭土作為栽培土質(zhì)。

2.1.3 不同培養(yǎng)容器對(duì)病菌致病性影響 由圖3可知，培養(yǎng)瓶中的西瓜幼苗發(fā)病率最高，為83.3%，顯著高于其他2種培養(yǎng)容器；培養(yǎng)皿和營(yíng)養(yǎng)缽之間的發(fā)病率差異不顯著。這可能與培養(yǎng)容器的保濕性有關(guān)，培養(yǎng)瓶能使病原菌處在高濕條件下，保證枯萎病在短期內(nèi)發(fā)病均勻、迅速，更好地發(fā)揮該方法快速鑒定的優(yōu)勢(shì)。

2.1.4 不同接種濃度對(duì)病菌致病性影響 由圖4可知，隨菌液接種濃度的增加，西瓜枯萎病的發(fā)病率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)枯萎病病菌分生孢子濃度為105個(gè)/mL時(shí)，枯萎病的發(fā)病率最高，為90.0%，其發(fā)病程度與分生孢子濃度為106、107個(gè)/mL之間差異不顯著，但三者均顯著高于其他3個(gè)濃度。因此，采用傷根蘸孢法接種時(shí)，建議采用枯萎病病菌的分生孢子濃度為105個(gè)/mL。

2.2 西瓜種質(zhì)資源抗枯萎病鑒定

采用篩選出的鑒定方法對(duì)40份西瓜材料資源進(jìn)行抗枯萎病鑒定，由表1可知，所測(cè)40個(gè)西瓜育種材料中沒(méi)有高抗枯萎病的種質(zhì)資源，但它們對(duì)枯萎病的抗性分化非常明顯，其中抗病材料有2份、中抗材料有13份、感病材料有18份、高感材料有7份，分別占鑒定資源的5.0%、32.5%、45.0%、17.5%。這與在田間病圃的自然發(fā)病程度基本一致，說(shuō)明鑒定結(jié)果準(zhǔn)確有效。

3 結(jié)論與討論

抗枯萎病鑒定是西瓜育種的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，苗期鑒定一直是抗枯萎病鑒定的一個(gè)重要組成部分，可使育種工作者及時(shí)了解育種材料的抗感性。而西瓜在田間苗期一般不發(fā)生枯萎病或發(fā)病較輕，如何有效接種并使西瓜幼苗發(fā)病，一直是影響抗病性鑒定成功與否的關(guān)鍵問(wèn)題。目前，國(guó)內(nèi)外在葫蘆科作物枯萎病苗期接種鑒定中采用的方法主要有蘸孢法(浸根法)、菌土法、灌根法、蘸胚根法等。雖然土壤拌菌法比較符合自然發(fā)病，但在實(shí)際操作中往往出苗不均勻或發(fā)病較輕[12]；蘸胚根法操作簡(jiǎn)便，但在接種后潛育期較長(zhǎng)，一般為 8～9 d[13]；灌根法存在發(fā)病率較低、穩(wěn)定性較差等缺點(diǎn)[14]。因此，蘸孢法(浸根法)在國(guó)內(nèi)外使用最為廣泛，其潛育期為 4 d 左右，且發(fā)病率較高[15]。本研究比較了4種西瓜枯萎病苗期接種方法，篩選出傷根蘸孢法為西瓜枯萎病接種的最佳方法，該方法在浸根接種方法的基礎(chǔ)上，對(duì)西瓜幼苗進(jìn)行了剪根處理。結(jié)果表明，通過(guò)剪根可以控制傷根的均勻程度，保證檢測(cè)結(jié)果更接近寄主本身的特性。該方法具有發(fā)病快而整齊、結(jié)果穩(wěn)定的特點(diǎn)，供試材料對(duì)枯萎病的抗性與田間實(shí)際情況基本吻合。

表1 不同西瓜種質(zhì)資源對(duì)枯萎病的抗性測(cè)定

接種濃度也是影響枯萎病抗性鑒定準(zhǔn)確性的重要因子之一[12]。孢子濃度過(guò)低，幼苗表現(xiàn)為抗性較強(qiáng)、發(fā)病較輕、病情指數(shù)較低，且發(fā)病潛育期長(zhǎng)，延長(zhǎng)了鑒定周期[16]。接種孢子濃度過(guò)高，則會(huì)增加孢子培養(yǎng)和孢子液制備的工作量，浪費(fèi)人力和物力。本試驗(yàn)結(jié)果表明，所用枯萎病病菌的分生孢子濃度為105個(gè)/mL時(shí)，能保證枯萎病在短期內(nèi)發(fā)病均勻、迅速，且其發(fā)病率顯著高于分生孢子濃度≤104個(gè)/mL時(shí)的發(fā)病率，這與王喜慶等的研究結(jié)果[10]一致。

枯萎病是一種土傳性病害，土壤因子條件的變化與病害的發(fā)生程度有著直接的關(guān)系。Wheeler等就田間土壤溫度、土壤濕度等條件對(duì)田間自然存在的枯萎病病原菌侵染植物的影響進(jìn)行研究，結(jié)果表明，枯萎病的發(fā)生隨土壤類型、土壤干燥時(shí)間的變化而變化[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以草炭土、高產(chǎn)土作為栽培土質(zhì)時(shí)，西瓜幼苗枯萎病的發(fā)病率較高；而李倫光的研究則認(rèn)為，隨著土壤中速效鉀、速效磷含量的減少，枯萎病的發(fā)病程度呈上升趨勢(shì)[18]。這可能與枯萎病的發(fā)生還受土壤含水量、pH值、土壤孔隙度等條件的制約有關(guān)，但具體原因還有待進(jìn)一步研究。本研究還發(fā)現(xiàn)，采用保濕效果較好的培養(yǎng)瓶作為培養(yǎng)容器，枯萎病的發(fā)病率較高，這與劉朋義對(duì)甜瓜抗枯萎病鑒定的研究結(jié)果[19]一致。

我國(guó)是世界上種植西瓜面積最大的國(guó)家。近年來(lái)我國(guó)西瓜栽培面積迅速擴(kuò)大，西瓜連作造成枯萎病發(fā)生越來(lái)越普遍、嚴(yán)重。大量研究表明，西瓜枯萎病抗性的遺傳是受單基因或單DNA片段控制的顯性遺傳[20]，利用抗枯萎病材料進(jìn)行雜交育種可以獲得抗枯萎病品種。本試驗(yàn)對(duì)40份不同來(lái)源的西瓜種質(zhì)資源的抗性鑒定結(jié)果可以看出，高感及感病的種質(zhì)材料所占的比例較大，其總和占鑒定總數(shù)的62.5%，高抗種質(zhì)資源缺乏，抗病資源僅占5.0%。因此，應(yīng)加強(qiáng)全國(guó)范圍內(nèi)西瓜枯萎病抗性種質(zhì)資源的收集和鑒定工作，為多抗新品種的選育提供更加優(yōu)良的材料。

本試驗(yàn)完善了西瓜枯萎病苗期接種鑒定技術(shù)體系，但研究?jī)H限于對(duì)接種方法、接種濃度、栽培土質(zhì)、培養(yǎng)容器等方面的探討，外界環(huán)境(如接種生育期、菌齡、溫度等)的變化會(huì)導(dǎo)致西瓜幼苗生理上的生長(zhǎng)緩慢和黃化，不可避免對(duì)表型鑒定結(jié)果有一定的影響。因此，開(kāi)展影響西瓜枯萎病苗期鑒定相關(guān)因素的綜合評(píng)價(jià)與分析，并結(jié)合分子標(biāo)記技術(shù)，建立西瓜枯萎病快速鑒定體系，以提高苗期鑒定的準(zhǔn)確性具有十分重要的意義。