陳周明，李媛媛，陳青微

麗水市中心醫(yī)院，浙江 麗水 323000

血虛肝郁證為肝血虧虛導(dǎo)致肝失疏泄調(diào)達(dá)，為肝失疏泄與肝血虧虛同時存在的復(fù)合中醫(yī)證候。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中肝臟能量代謝與物質(zhì)內(nèi)影響和中醫(yī)學(xué)中肝藏血功能密切相關(guān)，肝臟能量代謝同時參與了神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)內(nèi)免疫細(xì)胞因子和肽類激素等物質(zhì)的存儲及合成[1～2]。白芍性微寒、味苦，為中醫(yī)傳統(tǒng)的補(bǔ)血藥，主要治療氣郁不舒和肝失調(diào)達(dá)等。白芍既可滋肝陰養(yǎng)肝血，又可斂肝陰柔肝體，是養(yǎng)血柔肝的代表性中藥。芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷是白芍的主要成分。研究顯示，芍藥苷有抗驚厥、抑制形成凝血酶原、抗氧化、抗血小板聚集及改善血液微循環(huán)等生物學(xué)效應(yīng)，而芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)近似，為芍藥苷同分異構(gòu)體[3～4]。因此，本文通過觀察芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷對血虛肝郁證大鼠模型的影響，探究白芍“養(yǎng)血柔肝”功效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制及血虛肝郁證證候?qū)嵸|(zhì)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物 選取由浙江大學(xué)實(shí)驗動物中心提供健康SPF級，雄性SD大鼠48只，6周齡，體質(zhì)量(195.27±15.72)g，實(shí)驗動物許可證號為：SCXK(浙)2007-0029，飼養(yǎng)大鼠室內(nèi)溫度23～26℃，濕度40%～60%，光照周期為光∶暗(12 h∶12 h)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗。

1.2 藥物、試劑及儀器 藥物：芍藥內(nèi)酯苷(自制，含量高于98%)，芍藥苷(自制，含量高于96%)。試劑：電泳緩沖液、RIPA裂解液、磷酸蛋白酶抑制劑、HRP標(biāo)記山羊抗大鼠(武漢谷歌生物科技公司生產(chǎn))。甘氨酸(美國Solarbio公司生產(chǎn))。

儀器：封口機(jī)PF(溫州江南機(jī)械廠生產(chǎn)，型號：PF-S-200)，紫外分光光度計(上?，F(xiàn)科儀器公司生產(chǎn)，型號：752-P)，電泳儀(北京六一儀器廠，型號：DYY-6C)，臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)，型號：TGL-16C)，磁力攪拌器(常州澳華儀器公司生產(chǎn)，型號：79-1)，灰度分析軟件(美國Alpha Innotech公司生產(chǎn)，型號：alphaEaseFC)。

1.3 動物分組與模型制備 隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分成對照組、模型組、芍藥內(nèi)酯苷組及芍藥苷組4組，各12只。制備血虛肝郁大鼠模型。依據(jù)張建軍等[5]的方法，除對照組外，其余各組大鼠采用束縛結(jié)合孤養(yǎng)，束縛操作：每天上午8點(diǎn)至11點(diǎn)束縛3 h，共束縛3周，束縛期間大鼠飲食和光照均正常進(jìn)行，經(jīng)過移動束縛筒中內(nèi)底板位置無損傷將大鼠完全固定，大鼠掉頭、進(jìn)退限制，以不影響排泄、呼吸及不產(chǎn)生壓迫感為度。在實(shí)驗第8天時，使用60Coγ 射線對大鼠全身照射1次，照射距離為4 m，劑量率為191.55 Gy/h，照射劑量為3.5 Gy，照射后各組大鼠繼續(xù)束縛結(jié)合單籠飼養(yǎng)2周。大鼠造模第1天開始給藥，芍藥內(nèi)酯苷組灌胃30 mg/(kg·d)芍藥內(nèi)酯苷(等于2 g/kg白芍飲片)，芍藥苷組灌胃30 mg/(kg·d)芍藥苷(等于1.25 g/kg白芍飲片)，對照組和模型組灌胃等劑量生理鹽水，共灌胃3周。

1.4 觀察及檢測指標(biāo) 觀察大鼠一般活動情況；灌胃3周后將大鼠斷頭處死，在冰上快速剝離海馬，使用高效液相色譜-電化學(xué)檢測系統(tǒng)檢測海馬內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-羥吲哚乙酸(5-hy-droxyindole acetic acid，5-HIAA)、去甲腎上腺素(Norepinephrine，NE)、腎上腺素(Epinephrine，E)、5- 羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、多巴胺(Dopaminem，DA)水平及大鼠大腦皮層內(nèi)蛋白激酶A(Protein kinase A，PKA)水平，大鼠腹主動脈取血6 mL并在大鼠沒有死亡前，快速斷頭冰上分離并摘取大腦皮層，液氮冷凍保存。用蛋白免疫印跡法檢測大鼠海馬內(nèi)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、環(huán)磷酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate，cAMP)、磷酸化元件結(jié)合蛋白(P-cAMP-response element binding protein，P-CREB)及PKA蛋白表達(dá)狀況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以(±s)表示，采用單因素方差分析和獨(dú)立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般活動情況 與對照組比較，模型組大鼠出現(xiàn)尾巴、耳朵慢慢變蒼白，大部分時間懶動，反應(yīng)遲鈍，安靜時拱背，眼眶取血時血色較暗紅，食量降低等血虛癥狀，同時伴隨對糖水和周邊環(huán)境敏感性下降，毛發(fā)凌亂且色澤晦暗，灌胃時反抗較劇烈，警惕性高，喜歡蜷伏在角落等血虛肝郁表征；與模型組比較，芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷組大鼠狀態(tài)逐漸改善，眼睛、口唇顏色恢復(fù)正常，毛發(fā)整齊有光澤，活動度較好，對外界刺激較靈敏。

2.2 各組大鼠海馬內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和代謝產(chǎn)物水平比較見表1。與對照組比較，模型組大鼠海馬內(nèi)5-HIAA、NE、E、5-HT及DA水平均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組比較，芍藥內(nèi)酯苷組和芍藥苷組大鼠海馬內(nèi)5-HIAA、NE、E、5-HT及DA水平均較高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 各組大鼠大腦皮層內(nèi)PKA、cAMP水平比較 見表2。與對照組比較，模型組大鼠大腦皮層內(nèi)cAMP、PKA水平均下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組比較，芍藥內(nèi)酯苷組和芍藥苷組大鼠大腦皮層內(nèi)cAMP、PKA水平均較高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組大鼠海馬內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和代謝產(chǎn)物水平比較(±s) ng/g

表1 各組大鼠海馬內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和代謝產(chǎn)物水平比較(±s) ng/g

與對照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組 別對照組模型組芍藥內(nèi)酯苷組芍藥苷組D A 110.49±10.8286.21± 10.94①107.58± 10.63②108.14± 10.51②n E 121212125-H IA A 27.47±3.3022.98± 3.28①26.09± 3.42②26.12± 3.54②N E 28.39±5.4021.09±5.32①26.08± 5.31②26.31± 5.68②29.63±5.9719.89±6.07①25.75± 6.04②26.26± 6.13②5-H T 42.37±6.0235.18± 5.81①40.29± 5.46②40.11± 5.65②

表2 各組大鼠大腦皮層內(nèi)PKA、cAMP水平比較(±s)pmol/mg

表2 各組大鼠大腦皮層內(nèi)PKA、cAMP水平比較(±s)pmol/mg

與對照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組 別對照組模型組芍藥內(nèi)酯苷組芍藥苷組n 12121212 PK A 0.05±0.020.02± 0.01①0.04± 0.01②0.04± 0.01②cAMP 1.90±0.311.34± 0.25①1.84± 0.28②1.82± 0.24②

2.4 各組大鼠cAMP/PKA信號路徑內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá)比較 見表3。與對照組比較，模型組大鼠PKA、BDNF蛋白顯著降低，P-CREB蛋白顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，芍藥內(nèi)酯苷組和芍藥苷組大鼠PKA、BDNF蛋白顯著升高，P-CREB蛋白顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表3 各組大鼠cAMP/PKA信號路徑內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá)比較(±s)ppm

表3 各組大鼠cAMP/PKA信號路徑內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá)比較(±s)ppm

與對照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組 別對照組模型組芍藥內(nèi)酯苷組芍藥苷組n 12121212 PK A 8.02±0.311.95± 0.23①5.78± 0.27②6.23± 0.25②BD N F 4.02±0.492.25± 0.54①3.50± 0.52②3.56± 0.56②P-CREB 1.39±0.633.91± 0.72①1.64± 0.71②1.68± 0.69②

3 討論

血虛肝郁證多見于月經(jīng)不調(diào)、虛勞、脅痛及眩暈等婦科和內(nèi)科疾病中[6～7]。輻照聯(lián)合慢性束縛應(yīng)激建立的血虛肝郁證候模型為經(jīng)典中醫(yī)證候模型，輻照狀態(tài)下長時間束縛制動會導(dǎo)致大鼠的困境心理應(yīng)激狀況，在病因上模擬情志病患者前期情志不暢、所愿不遂，引起肝氣郁結(jié)的發(fā)病特征[8]。肝藏血，體獲得陰柔則能陽剛；肝疏泄，用能陽剛則體得陰柔，泄藏互用，相反相成。調(diào)肝以養(yǎng)護(hù)肝血，先要柔肝體，白芍可酸斂氣機(jī)、陰柔養(yǎng)血，不僅能夠安已亂之氣機(jī)，還能夠護(hù)肝臟之陰血，切中病機(jī)[9～11]。

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)為調(diào)節(jié)機(jī)體精神活動、行為狀態(tài)和情緒的主要物質(zhì)，包含5-HT和兒茶酚胺等，其中兒茶酚胺包含DA、E及NE等，研究顯示，在抑郁癥等精神疾病中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)對患者發(fā)病有重要影響[12～14]。本研究顯示，芍藥內(nèi)酯苷組和芍藥苷組大鼠5-HIAA、NE、E、5-HT及DA水平均高于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，說明芍藥苷及芍藥內(nèi)酯苷都能夠提升大鼠機(jī)體內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量，增強(qiáng)外周交感神經(jīng)的興奮性。大鼠cAMP/PKA信號路徑內(nèi)，G蛋白藕聯(lián)受體能夠結(jié)合很多神經(jīng)遞質(zhì)，活化造成腺苷酸環(huán)化酶(Adenylyl cyclase，AC)活性上升，進(jìn)而使cAMP含量升高來激活PKA，活化PKA可以使CREB發(fā)生磷酸化，轉(zhuǎn)錄因子活性得到調(diào)節(jié)，介導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生對外界刺激反應(yīng)[15～16]。BDNF可以加速神經(jīng)元分化，保持神經(jīng)元成長，修復(fù)神經(jīng)元損傷。本研究顯示，模型組大鼠海馬組織內(nèi)BDNF與PKA表達(dá)降低，在灌胃治療后PKA和BDNF蛋白較模型組升高，說明模型組大鼠大腦皮層內(nèi)PKA活性下降、cAMP水平降低，同時海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)BDNF和PKA蛋白表達(dá)降低，肝郁血虛大鼠腦組織的神經(jīng)元內(nèi)cAMP/PKA信號路徑紊亂，并引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)的病理變化，芍藥苷與芍藥內(nèi)酯苷可激活PKA活性，使cAMP水平升高，上調(diào)BDNF與PKA蛋白表達(dá)量。

綜上，芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷可調(diào)節(jié)血虛肝郁大鼠神經(jīng)遞質(zhì)含量，調(diào)控大鼠機(jī)體內(nèi)cAMP/PKA信號路徑內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá)，從而起到保護(hù)神經(jīng)作用，它們都是白芍養(yǎng)血柔肝的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。