蘭瑞，張勇，馬云枝，吳濤，鄭海忠，古春青，李亞娜，武繼濤

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450004

2.鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052

3.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450008

腦卒中是一組突然起病，以局灶性神經(jīng)功能缺失為特征的急性腦血管病，好發(fā)于中年人，是威脅人類生命和致殘的重要因素之一，缺血性腦卒中約占腦卒中的60%～80%[1～2]。因其高致殘率、高病死率，一直是研究熱點。中醫(yī)學(xué)為中風(fēng)的診療積累了豐富的治療經(jīng)驗。小續(xù)命湯來源于唐代名醫(yī)孫思邈的《備急千金要方》，臨床應(yīng)用治療中風(fēng)效果顯著[3～5]，本課題組在前期研究的基礎(chǔ)上，建立腦缺血再灌注損傷大鼠模型，觀察小續(xù)命湯對急性腦缺血再灌注損傷后皮層缺血半暗帶線粒體相關(guān)蛋白的表達(dá)，以期為小續(xù)命湯的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量250～280 g，購自河南省實驗動物中心，實驗動物許可證號：SCXK(豫)2017-0001。

1.2 小續(xù)命湯藥物制備 中藥材統(tǒng)一采購于河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診中藥房。小續(xù)命湯中麻黃、桂枝、芍藥、川芎、黃芩、杏仁、附子、甘草、人參、防己、防風(fēng)、生姜以1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1.5∶5 的比例配藥，將中藥材水浸1 h后，用10倍體積水煎1 h，濾取上清，再加10倍體積水煎1 h，重復(fù)3次。合并3次所得藥汁并濃縮至100%濃度，冷卻后加入無水乙醇使其達(dá)到總體積的75%，磁力攪拌過夜，25000×g離心20 min后取上清。藥渣收集后用75%乙醇浸泡，過濾后收集上清，與離心所得的上清合并，恒溫蒸發(fā)盡酒精，用蒸餾水調(diào)藥物濃度至1 g/mL[6～8]。

1.3 主要試劑及儀器 兔抗Hsp60抗體購自Cell Signal Signal公司，貨號12165S，兔抗Mitofilin抗體購自Abcam公司，貨號ab48139，羊抗兔IgG二抗購自杭州華安生物技術(shù)有限公司，貨號HA1001。環(huán)孢素A、通用SP檢測試劑盒購自Solarbio，貨號分別為SC5120、SP0041。凝膠配置試劑盒、ECL顯色試劑盒購自西安晶彩生物科技有限公司，貨號分別為JC-PE022，JC-PC001。電子天平(啟東友銘衡量有限公司)，系列磁力攪拌器(河南愛博特科技發(fā)展有限公司)，SSW型電熱恒溫水浴箱(上海博迅實業(yè)有限公司)。電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、凝膠成像儀、PVDF膜均購自BIO-RAD，優(yōu)普系列超純水儀器(成都超純科技有限公司)，光學(xué)顯微鏡(日本尼康公司)。

1.4 模型的制作 10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，常規(guī)皮膚消毒后，沿頸部中線偏左側(cè)皮膚剪開，鈍性分離肌肉，將頸外動脈遠(yuǎn)端結(jié)扎，近心端結(jié)扎備用后，結(jié)扎頸總動脈遠(yuǎn)心端，確保動脈夾完全夾閉頸內(nèi)動脈，沿著頸外動脈遠(yuǎn)端結(jié)扎處剪斷一V型小口，將1根3.0 mm尼龍絲線插入動脈后，沿小口徹底剪斷頸外動脈。將頸外動脈殘端沿著頸內(nèi)動脈拉直，緩慢推進絲線至有阻力停止，離頸總動脈分叉處約19.5 mm結(jié)扎備線。動脈阻塞90 min后緩慢輕柔拉出絲線實現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組步驟同上，僅進行動脈分離但不插入絲線。待大鼠蘇醒后評估神經(jīng)功能缺損，出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀視為模型制作成功。

1.5 動物分組及給藥 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)小續(xù)命湯60 g/(kg·d)為治療急性腦缺血再灌注損傷的最優(yōu)劑量[6]。本研究將60只實驗動物隨機分為假手術(shù)(Sham)組，模型(IR)組，小續(xù)命湯(XXMD60)組，環(huán)孢素A(CsA)組和溶媒(Vehicle)組。用乙醇溶解陽性藥環(huán)孢菌素A，按照配制環(huán)孢素A的劑量比配制相應(yīng)的溶劑。XXMD60組給予相應(yīng)劑量的小續(xù)命湯，Sham組、IR組給予相應(yīng)劑量的雙蒸水，CsA組以10 mg/(kg·d)的CsA腹腔注射。Vehicle組每天以相應(yīng)劑量的溶劑腹腔注射，持續(xù)至處死大鼠。所有的給藥均在實驗前3天開始連續(xù)進行灌胃直到研究設(shè)定的觀察時間點。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 觀察一般情況 研究期間觀察并記錄實驗大鼠的毛色、活動、進食飲水，稱量體質(zhì)量。

1.6.2 測定神經(jīng)行為學(xué) 依據(jù)Longa EZ等[9]介紹的方法，進行神經(jīng)功能缺損的評估。0分：無神經(jīng)功能缺損；1分：病灶對側(cè)前爪不能完全伸展；2分：向病灶對側(cè)自發(fā)性旋轉(zhuǎn)；3分：向病灶對側(cè)傾倒；4分：無自發(fā)性行走且出現(xiàn)意識喪失。

1.6.3 Nissl染色觀察細(xì)胞缺血損傷 腦缺血再灌注24 h后，實驗大鼠深度麻醉后，經(jīng)心臟灌注生理鹽水200 mL待右心耳流出液體清亮后，換4%多聚甲醛溶液勻速灌注300 mL。取出腦組織放置于4%多聚甲醛溶液后固定24 h，經(jīng)梯度脫水，石蠟包埋，切片。腦組織石蠟切片58℃烤片2 h。經(jīng)脫臘、水化后，將切片放入1%甲苯胺藍(lán)染色液中，50℃染色30 min。PBS洗3次，各5 min。經(jīng)脫水后中性樹膠封片，自然晾干。光學(xué)顯微鏡下觀察缺血皮層半暗帶區(qū)觀察缺血性損害，并拍片。

1.6.4 Western blot檢測Hsp60、mitofilin蛋白的表達(dá) 取新鮮腦缺血半暗帶皮層組織100 mg，剪碎放入1.5 mL離心管中，將1 mL RIPA加入離心管，放置快速研磨儀中研磨4 min后，冰上靜置15 min，將蛋白溶液置于4℃ 13000 r/min離心15 min，取上清液。應(yīng)用BCA法進行蛋白濃度檢測。用10%～12%SDS聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，蛋白分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。將PVDF膜放于封閉液，室溫?fù)u床上2 h，用5%BSA溶液將一抗稀釋成合適的濃度后滴加至PVDF膜，4℃搖床上孵育過夜；次日TBST洗膜3次，每次10 min；將HRP標(biāo)記的二抗用5%BSA溶液稀釋為1∶2000滴加至PVDF膜，室溫?fù)u床上孵育2 h；TBST洗滌后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒在凝膠成像分析系統(tǒng)顯影，分析條帶灰度值。

1.6.5 免疫組織化學(xué)染色檢測Hsp60、mitofilin蛋白的定位表達(dá) 經(jīng)烤片、脫臘、水化后，將片子插入檸檬酸修復(fù)溶液放置于微波爐進行修復(fù)抗原。PBS洗片，3%H2O2溶液滴加至切片上室溫處理20 min。PBS洗片后，5%BSA封閉液滴加至組織上，室溫封閉60 min。滴加相應(yīng)稀釋濃度的一抗4℃過夜，PBS洗3次，每次5 min。滴加合適稀釋溶度的HRP標(biāo)記抗兔二抗37℃孵育1 h。PBS洗3次，每次5 min。按照試劑盒說明書配制DAB顯色試劑，混勻后滴加至切片，顯微鏡下觀察顯色情況，自來水洗15 min。蘇木素復(fù)染5 min后，自來水洗15 min。1%鹽酸酒精迅速分化。梯度脫水后，中性樹膠封片，自然晾干。光學(xué)顯微鏡下觀察缺血皮層半暗帶陽性細(xì)胞并拍攝照片。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以(±s)表示。統(tǒng)計學(xué)差異由單因素方差分析進行檢驗，方差齊性檢驗后用t檢驗和post hoc Fisher's檢驗分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況及神經(jīng)功能缺損評分比較 見表1。造模前各組大鼠體質(zhì)量、一般情況無差異。造模后，與Sham組比較，IR組大鼠毛發(fā)黃暗，活動能力顯著下降，進食飲水困難，體質(zhì)量均顯著下降(P＜0.05)，均表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)功能缺損(P＜0.05)；與IR組比較，Vehicle組無顯著性差異；XXMD60組、CsA組大鼠毛發(fā)發(fā)黃，活動能力受限，進食飲水較正常，反應(yīng)較迅速，神經(jīng)功能缺損評分顯著下降(P＜0.05)，體質(zhì)量明顯上升(P＜0.05)。

表1 各組大鼠造模前后體質(zhì)量及神經(jīng)功能缺損評分比較(±s)

表1 各組大鼠造模前后體質(zhì)量及神經(jīng)功能缺損評分比較(±s)

與假手術(shù)組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組 別Sham組IR組X X M D60組CsA組V ehicle組n 5 5 5 5 5造模前體質(zhì)量(g)282.12±35.21285.27±31.18283.19±30.53279.25±38.44284.36±19.26造模后體質(zhì)量(g)308.45±32.32261.28±33.54①278.43±34.22②281.38±42.19②268.36±35.63神經(jīng)功能缺損評分(分)02.83±0.16①1.78±0.21②1.62±0.26②2.75±0.19

2.2 各組大鼠大腦皮層缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞結(jié)果比較 見圖1、圖2。Nissl染色結(jié)果顯示，Sham組皮層神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，數(shù)量多，排列有序，細(xì)胞形態(tài)清晰飽滿，細(xì)胞核圓。IR組、Vehicle組則見缺血區(qū)大片淡染，缺血再灌注半暗帶區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列雜亂，細(xì)胞質(zhì)體積小，嚴(yán)重呈空泡樣變，細(xì)胞核呈皺鎖深染色。XXMD60組、CsA組細(xì)胞排列較整齊，細(xì)胞形態(tài)較正常，細(xì)胞層數(shù)略少，細(xì)胞質(zhì)較飽滿，與IR組比較損傷明顯減輕。

圖1 各組大鼠大腦皮層缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞損害結(jié)果 (×200)

圖2 各組大鼠大腦皮層缺血半暗帶完整細(xì)胞數(shù)

2.3 各組大鼠大腦皮層缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞Hsp60、mitofilin的表達(dá)和分布結(jié)果比較 見表2，圖3～5。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，Sham組Hsp60、mitofilin的陽性細(xì)胞數(shù)較少。與Sham組比較，IR組、Vehicle組可見神經(jīng)細(xì)胞呈缺血再灌注損傷表現(xiàn)，細(xì)胞皺縮，空泡改變，陽性細(xì)胞呈褐色，主要表達(dá)在胞漿，大腦皮層缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞Hsp60、mitofilin的表達(dá)明顯升高(P＜0.05)。與IR組比較，XXMD60組、CsA組大鼠大腦皮層缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注損傷較輕，細(xì)胞形態(tài)較為正常，兩種蛋白陽性細(xì)胞數(shù)較IR組顯著升高(P＜0.05)。

圖4～5結(jié)果顯示，Sham組Hsp60、mitofilin兩種蛋白的表達(dá)均較低，與Sham組比較，IR組、Vehicle組上述2種蛋白的表達(dá)均顯著上調(diào)(P＜0.05)；與IR組比較，XXMD60組、CsA組上述兩種蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)(P＜0.05)。

3 討論

腦缺血再灌注屬于中醫(yī)學(xué)中風(fēng)范疇，中醫(yī)理論認(rèn)為中風(fēng)多由風(fēng)、火、痰、瘀等引起，導(dǎo)致臟腑陰陽失調(diào)、氣血逆亂、直沖犯腦或腦脈閉阻而發(fā)病。臨床上中風(fēng)辯證分為中經(jīng)絡(luò)或中臟腑。中經(jīng)絡(luò)當(dāng)祛邪活絡(luò)為要，中臟腑則醒神開竅為先。中經(jīng)絡(luò)者發(fā)病特點為正氣虧虛，氣血不和，脈絡(luò)空虛，風(fēng)邪乘虛入中經(jīng)絡(luò)，氣血痹阻，肌膚筋脈失于濡養(yǎng)，癥見神志不清，半身不遂，肢麻脹痛，言語不利等癥狀，故以祛風(fēng)活絡(luò)為主。小續(xù)命湯首載于唐代名醫(yī)孫思邈的《備急千金要方》，具有祛風(fēng)通絡(luò)，活血化瘀之功效。臨床治療中風(fēng)辯證治療中風(fēng)患者收效良好，可減輕患者的神經(jīng)功能缺損，改善生活質(zhì)量[3～5]。本研究結(jié)果顯示，小續(xù)命湯可顯著降低腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)能缺損評分，明顯減輕神經(jīng)細(xì)胞缺血性損傷及腦梗死體積形成，提示小續(xù)命湯對腦缺血再灌注損傷有神經(jīng)保護作用。

圖3 各組大鼠大腦皮層缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞Hsp60、mitofilin表達(dá)結(jié)果 (×200)

圖4 各組大鼠大腦皮層缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞Hsp60、Mitofilin蛋白表達(dá)情況

圖5 各組大鼠大腦皮層缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞Hsp60、Mitofilin蛋白定量表達(dá)

表2 各組大鼠大腦皮層缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞Hsp60，mitofilin表達(dá)結(jié)果比較(±s) 個

表2 各組大鼠大腦皮層缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞Hsp60，mitofilin表達(dá)結(jié)果比較(±s) 個

與Sham組比較，①P＜0.05；與IR組比較，②P＜0.05

組 別Sham組IR組X X M D 60組CsA組V ehicle組n44444 H sp60陽性細(xì)胞數(shù)5.23±1.9832.16±3.52①56.27±4.34②59.35±3.32②33.23±4.15①mitofilin陽性細(xì)胞數(shù)4.23±2.1828.35±4.26①49.27±3.24②52.46±3.48②27.16±3.55①

腦缺血再灌注損傷根據(jù)血供減少的程度分為核心區(qū)和缺血半暗帶，后者為挽救的關(guān)鍵部位。線粒體是極其關(guān)鍵的細(xì)胞器，為能量代謝、ATP生成、氧化磷酸化的重要場所，負(fù)責(zé)線粒體DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄，線粒體蛋白翻譯，鈣存儲、生產(chǎn)和清除氧化產(chǎn)物，隔離促凋亡蛋白維持細(xì)胞存活[10]。腦缺血再灌注可導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，進而觸發(fā)ATP過度消耗細(xì)胞壞死、凋亡等一系列的事件[11]。文獻報道環(huán)孢素A可抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，減少線粒體損傷進而發(fā)揮神經(jīng)保護作用[12～13]，本研究設(shè)立環(huán)孢素A組作為陽性對照，關(guān)注缺血半暗帶區(qū)線粒體蛋白，進一步探討小續(xù)命湯對缺血半暗帶區(qū)Hsp60、Mitofilin表達(dá)的影響。

Hsp60是一種重要的分子伴侶，主要存在真核細(xì)粒體基質(zhì)中。研究發(fā)現(xiàn)Hsp60基因由粒線體中未折疊蛋白質(zhì)的累積選擇性誘導(dǎo)，誘導(dǎo)Hsp60表達(dá)可減少神經(jīng)元的缺血性損傷[14～15]。本研究結(jié)果與報道一致，腦缺血可導(dǎo)致Hsp60的表達(dá)升高[15～16]，與模型組比較，小續(xù)命湯、環(huán)孢素A能顯著上調(diào)缺血半暗帶Hsp60的表達(dá)，進而可能發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

Mitofilin是線粒體重要的內(nèi)膜嵴形態(tài)維持蛋白，參與線粒體多項功能的調(diào)控，下調(diào)Mitofilin的表達(dá)影響線粒體功能，使得其受損，表現(xiàn)為可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜結(jié)構(gòu)紊亂，改變線粒體網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，降低線粒體呼吸鏈復(fù)合體V活性，減少活性線粒體數(shù)量及細(xì)胞ATP產(chǎn)量等[17]。還有研究者發(fā)現(xiàn)Mitofilin還與聚合酶I相互作用，促進PARP-1向線粒體定位，該蛋白的缺失會導(dǎo)致線粒體DNA損傷積累[18]。Mitofilin蛋白在腦缺血再灌注這一應(yīng)激創(chuàng)傷后表達(dá)上調(diào)，而小續(xù)命湯與環(huán)孢素A治療顯著上調(diào)該蛋白的表達(dá)，從而可能抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生。

綜上，小續(xù)命湯干預(yù)誘導(dǎo)Hsp60、Mitofilin蛋白上調(diào)表達(dá)，保護神經(jīng)細(xì)胞損傷，可能為小續(xù)命湯治療腦缺血再灌注損傷的作用靶點。