陳 雪，沈 楠，安 英，徐 博，趙麗晶

(吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，吉林 吉林132013)

丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)的干燥根及根莖，是最常用的活血化瘀中藥之一，具有祛瘀止痛和養(yǎng)血安神的功效。現(xiàn)代藥理研究[1-3]顯示：丹參具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、防治心肌缺血和心肌梗死、改善微循環(huán)及降低心肌耗氧量等作用，被廣泛應(yīng)用于心血管系統(tǒng)疾病的治療。目前，已經(jīng)從丹參中提取的化學(xué)成分主要包括脂溶性的二萜類醌類化合物和水溶性的酚酸類成分[4-6]。丹酚酸B是丹參的水溶性成分，是三分子丹參素與一分子咖啡酸縮合而成[7-9]，有關(guān)丹酚酸B的研究主要集中在其提取工藝和其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用[10-12]，而其對(duì)心肌細(xì)胞的影響未見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)采用過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2)建立體外乳鼠心肌氧化應(yīng)激損傷模型，觀察丹酚酸B對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用并探討其相關(guān)機(jī)制，為丹酚酸B在保護(hù)心肌中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器 Wistar乳鼠20只，清潔級(jí)，2 d齡，雌雄各半，購(gòu)自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(吉)2008-0005。丹酚酸B購(gòu)自陜西森弗高科實(shí)業(yè)有限公司(批號(hào)20130903)，H2O2美國(guó)購(gòu)自Sigma 公司(批號(hào)3135-1)，谷胱甘肽(glutathione, GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide Dismutase, SOD)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程公司(批號(hào)20140428)，乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)和肌酸激酶(creatine kinase, CK)ELISA試劑盒購(gòu)自上海信然生物科技有限公司(批號(hào)20131125)。

1.2 乳鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)及分組 乳鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)[7]。75% 乙醇常規(guī)消毒乳鼠，迅速分離心臟，并用組織剪將心肌徹底剪碎，加入約10倍心臟體積的0.125% 胰酶, 于37℃水浴、震蕩消化 5～7 min。向所得的消化液中加入等量的含20%新生牛血清的DMEM 培養(yǎng)液以終止胰酶作用。收集細(xì)胞懸液, 1 200 r·min-1離心5 min, 棄去上清, 細(xì)胞沉淀用含20% 血清的DMEM培養(yǎng)液重懸, 接種于培養(yǎng)瓶中, 用差速貼壁法去除成纖維細(xì)胞等非心肌細(xì)胞。心肌細(xì)胞懸液計(jì)數(shù), 用含20%新生牛血清的DMEM 培養(yǎng)液稀釋至所需的細(xì)胞密度, 同時(shí)加入0.1 mmol·L-15-溴脫氧尿苷抑制成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng), 接種到6孔培養(yǎng)板(細(xì)胞密度為每毫升3×105個(gè)細(xì)胞) 中, 于37℃、5%CO2條件培養(yǎng)。48 h后更換新鮮的含20%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，72 h時(shí), 培養(yǎng)的心肌細(xì)胞均伸出偽足, 且大部分已經(jīng)匯合成片, 自主搏動(dòng)良好。將原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、低和高劑量丹酚酸B組，除正常對(duì)照組外，其余各組培養(yǎng)液中加入終濃度為100 μmoL·L-1的H2O2造成心肌細(xì)胞氧化損傷，低和高劑量丹酚酸B組同時(shí)分別加入終濃度為20和40 μmol·L-1丹酚酸B, 正常對(duì)照組加入等體積含20%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)4 h后，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)，并收集細(xì)胞和培養(yǎng)液上清，進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.3 倒置顯微鏡觀察心肌細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn) 各組心肌細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)并拍照。

1.4 MTT法檢測(cè)心肌細(xì)胞存活率 各組心肌細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后，向各孔中加入100 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，加入400 μL DMSO溶液，震蕩10 min，采用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處吸光度(A)值，計(jì)算心肌細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(各組細(xì)胞A值/正常組細(xì)胞A值)×100%。

1.5 心肌細(xì)胞中GSH和MDA水平及SOD活性測(cè)定 各組細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后，用0.1%胰蛋白酶消化，1 000 r·min-1離心5 min收集細(xì)胞，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明采用分光光度計(jì)測(cè)定GSH和MDA水平及SOD活性。

1.6 心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH和CK水平測(cè)定 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，4 000 r·min-1離心10 min，小心吸取上清，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明采用酶標(biāo)儀測(cè)定上清中LDH和CK水平。

2 結(jié) 果

2.1 光鏡下各組心肌細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)和特征 與正常對(duì)照組比較，模型組心肌細(xì)胞部分懸浮在培養(yǎng)液中，貼壁細(xì)胞數(shù)量減少，心肌細(xì)胞偽足回縮，體積變小，心肌細(xì)胞自律搏動(dòng)明顯緩慢。與模型組比較，低和高劑量丹酚酸B組心肌細(xì)胞數(shù)目明顯增多，偽足回縮少，自律搏動(dòng)增強(qiáng)，其中高劑量丹酚酸B組對(duì)心肌形態(tài)改善程度優(yōu)于低劑量丹酚酸B組。見圖1。

A: Control group; B: Model group; C: 20 μmol·L-1salvianolic acid B group; D: 40 μmol·L-1 salvianolic acid B group.

2.2 各組心肌細(xì)胞存活率 與正常對(duì)照組比較，模型組24和48 h心肌細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，高劑量丹酚酸B組心肌細(xì)胞存活率明顯升高(P<0.05或P<0.01)。見表1。

2.3 各組心肌細(xì)胞中GSH和MDA水平及SOD活性 與正常對(duì)照組比較，模型組心肌細(xì)胞中GSH水平明顯降低(P<0.01)，MDA水平明顯升高(P<0.01)，SOD活性降低(P<0.01)。與模型組比較，低和高劑量丹酚酸B組GSH水平升高(P<0.05或P<0.01)，而MDA水平降低(P<0.01)，SOD活性升高(P<0.05或P<0.01)。見表2。

2.4 各組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH和CK水平 與正常對(duì)照組比較，模型組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH和CK水平明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，低和高劑量丹酚酸B組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH和CK水平均明顯降低(P<0.05或P<0.01)。見表3。

表1 各組乳鼠心肌細(xì)胞存活率

Tab.1 Survival rates of cardiomyocytes of suckling rats in various groups (n=4,±s,η/%)

*P<0.01 compared with normal control group;△P<0.05,△△P<0.01 compared with model group.

表2 各組乳鼠心肌細(xì)胞中GSH和MDA水平及SOD活性

*P<0.01 compared with normal control group,△P<0.05，△△P<0.01 compared with model group.

表3 各組乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH和CK水平

Tab.3 Levels of LDH and CK in culture medium of cardiomyocytes of suckling rats in various groups [n=4,±s,λB/(U·mL-1)]

*P<0.01 compared with normal control group;△P<0.05,△△P<0.01 compared with model group.

3 討 論

活性氧(reactive oxygen species,ROS)是細(xì)胞內(nèi)多種氧化還原反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，其生成和清除處于動(dòng)態(tài)平衡中。在各種損傷因素的作用下，ROS生成增多，出現(xiàn)氧化應(yīng)激，ROS在體內(nèi)增多并參與氧化生物大分子的形成，誘發(fā)基因突變、蛋白質(zhì)變性和脂質(zhì)過(guò)氧化，進(jìn)而損傷溶酶體和線粒體等，最終導(dǎo)致細(xì)胞的氧化損傷[13-16]。氧化應(yīng)激損傷在心肌缺血、心肌再灌注損傷及心力衰竭等病理變化中起到重要作用[17-19]。心肌細(xì)胞損傷過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA水平升高以及GSH和SOD酶活性降低，同時(shí)會(huì)引起心肌細(xì)胞內(nèi)LDH及CK釋放，引起血清內(nèi)其水平的升高[20-21]，如何有效降低氧化應(yīng)激對(duì)心肌細(xì)胞的損傷已成為心血管病領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。

丹酚酸B是丹參水溶性酚酸類成分的主要活性物質(zhì)，目前有關(guān)其在抗氧化應(yīng)激損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用相關(guān)文獻(xiàn)未見報(bào)道。本研究利用H2O2制備體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞氧化損傷模型，研究丹酚酸B對(duì)H2O2致氧化應(yīng)激損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組比較，模型組心肌細(xì)胞出現(xiàn)貼壁細(xì)胞減少、偽足回縮等細(xì)胞損傷性變化，同時(shí)細(xì)胞存活率也明顯降低；心肌細(xì)胞中GSH水平降低，MDA水平升高，SOD活性降低；由于心肌細(xì)胞損傷，心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中釋放的LDH和CK水平增多。脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA水平及SOD活性可直接反映心肌細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化的速度與程度，并間接反映細(xì)胞損傷的程度，且與氧自由基的生成情況也有必然聯(lián)系。本研究結(jié)果顯示：心肌細(xì)胞經(jīng)丹酚酸B處理后，細(xì)胞形態(tài)學(xué)損傷變化減輕，細(xì)胞存活率增加；同時(shí)細(xì)胞中心肌細(xì)胞中GSH水平增多，MDA水平降低，SOD活性升高、心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH和CK水平降低，提示丹酚酸B能夠減輕心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的程度，增強(qiáng)心肌細(xì)胞抗氧化防御的能力。

綜上所述，丹酚酸B對(duì)氧化應(yīng)激損傷心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其通過(guò)增加清除氧自由基、發(fā)揮抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用、進(jìn)而提高心肌細(xì)胞的抗氧化損傷能力有關(guān)。本研究結(jié)果對(duì)臨床上心肌病的預(yù)防與治療具有一定的參考價(jià)值，也為丹酚酸B在防治與氧化應(yīng)激性損傷有關(guān)的心臟疾病的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。