張玉英 楊炳翠 賈 琴 吳 爽 李艷萍

(廣東藥科大學(xué)人體解剖學(xué)與組織學(xué)胚胎學(xué)系, 廣州 510006)

龍血竭(Draconis Sanguis)被譽為“活血之圣藥”,可誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[1]。龍血素A(Loureirin A)是龍血竭內(nèi)一種黃酮類化合物,其分子式為4-羥基-2,6-二甲氧基二氫查爾酮,其含量豐富[2]。目前,關(guān)于龍血素A的藥效研究甚少。本研究基于龍血竭可誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的事實,探討龍血素A對體外培養(yǎng)人乳腺癌MCF-7細胞增殖及凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 細胞株和主要試劑

人乳腺癌MCF-7細胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞庫;龍血素A對照品(分子量286.32,純度≥98%)購自中國藥品生物制品檢定所;胎牛血清和RPMI1640培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司;annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 細胞培養(yǎng)

人乳腺癌MCF-7細胞從液氮罐取出復(fù)蘇后,用含10%胎牛血清、100IU/ml青霉素和100IU/ml鏈霉素的高糖RPMI1640細胞培養(yǎng)液于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)4代后,細胞狀態(tài)良好,用于實驗。

1.3 MTT法檢測MCF-7增殖

取對數(shù)生長期細胞以1×104/孔接種于96孔板中,制成飛片,設(shè)對照組和8個不同試受藥物濃度的藥物組,每組設(shè)6個復(fù)孔。對照組加入培養(yǎng)基90μl,藥物組分別加入濃度為15、30、45、60、75、90、105、120μmol/L的龍血素A各90μl,藥物共培養(yǎng)24、48、72h后,各組每孔分別加入MTT(5g/L)10μl,繼續(xù)培養(yǎng)4h后,吸棄培養(yǎng)液,每孔分別加入DMSO 100μl,避光溶解后取出飛片,用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長下測定吸光度值(A值),A值與活細胞數(shù)呈正向關(guān)系,各平行復(fù)孔的A值取平均數(shù)值;以時間為橫坐標(X),A值為縱坐標(Y)繪制細胞活性曲線圖;計算細胞生長抑制率,細胞生長抑制率(%)=(1-用藥組A值/對照組A值)×100,應(yīng)用GraghPad Prism 5軟件計算出IC50值,并選取最佳濃度進行下游實驗。

1.4 免疫熒光檢測Ki67的表達

取對數(shù)生長期的細胞以1×105個/孔接種于12孔板,制成飛片,每組設(shè)3個復(fù)孔。藥物組加入1ml的60μmol/L龍血素A,對照組加入1ml的培養(yǎng)基,作用24h后,加500μl的0.1%Triton X-100,PBS漂洗,加500μl的5%BSA,室溫封閉30min;滴加一抗Ki67(1∶100),對照滴加PBS,4℃孵育過夜;滴加二抗Dylight 405標記山羊抗兔IgG(1∶500),37℃孵育1h;滴加DAPI避光孵育5min,PBS洗3次;滴加25μl 抗熒光猝滅劑,取出飛片,封片后于熒光顯微鏡下觀察。每組選3張飛片,每張飛片選取3個不同視野,用ZEISS AX10 image analysis圖像分析系統(tǒng)計算免疫熒光陽性細胞的面數(shù)密度。

1.5 免疫印跡檢測Bax、Bcl-XL/S的表達

取對數(shù)生長期細胞以1×105個/孔接種于12孔板,制成飛片,每組設(shè)3個復(fù)孔。藥物組加入1ml的60μmol/L龍血素A,對照組加入1ml的培養(yǎng)基,分別作用24、48、72h后,胰酶消化收集細胞,加400μl RIPA裂解液,冰浴30min,4℃,12000r/min冷凍離心5min(r=7.0cm),取上清,用聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳,PVDF轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉室溫封閉1h,加入一抗(抗Bax 1∶5000和抗Bcl-XL/S抗體1∶5000)4℃孵育過夜,TBST洗10min×3次,滴加二抗37℃孵育1h,TBST洗5min×3次;取出飛片,ECL化學(xué)發(fā)光液檢測,Image pro-plus 6.0圖像分析軟件對電泳條帶灰度進行測定。

1.6 Annexin V-FITC/PI雙染流式檢測細胞凋亡

取對數(shù)生長期細胞以2×105個/孔接種于6孔板中,制成飛片,培養(yǎng)過夜,棄培養(yǎng)液,藥物組加入2ml的60μmol/L龍血素A,對照組加入2ml的培養(yǎng)液,每組設(shè)置3個復(fù)孔,置CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng);作用72h后,收集各組細胞,PBS洗2次,重懸細胞,加5μl annexin V-FITC,避光室溫孵育15min,再加10μl碘化丙啶染色液;室溫避光孵育20min,取出飛片,用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

本實驗采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計,用t檢驗進行顯著性分析,組間分析用析因設(shè)計方差分析。

2 結(jié)果

2.1 細胞增殖

結(jié)果顯示(表1),龍血素A可抑制MCF-7細胞增殖,其作用隨著濃度的增加而增強,隨著時間的增加而增強,呈劑量和時間依賴關(guān)系。經(jīng)GraghPad Prism 5軟件計算得出IC50值： 53.13μmol/L,取60μmol/L 為最佳實驗濃度進行下游實驗。

2.2 Ki67的表達

Ki67主要表達于細胞核,呈綠色(圖1);圖像分析結(jié)果顯示,龍血素A作用MCF-7細胞24h后,Ki67陽性細胞的面數(shù)密度值為(21.35±3.24),與對照組(30.35±3.04)比較明顯減少(P<0.05)。

2.3 免疫印跡檢測Bax、Bcl-XL/S的表達

龍血素A分別作用MCF-7細胞24、48、72h后,與對照組相比,各時間段Bax蛋白的表達顯著增加(P<0.05),并呈時間依賴性;各時間段Bcl-XL/S蛋白的表達則顯著減少(P<0.05),但Bcl-XL/S表達在24h與48h之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。

2.4 細胞凋亡

龍血素A作用72h后,細胞的凋亡率為34.60%±6.80%,顯著高于對照組7.23%±1.40%(P<0.05)(圖3)。

表1 不同濃度龍血素A及不同作用時間對MCF-7細胞增殖的影響

*P<0.05vscontrol;△P<0.05vsthe previous concentration;#P<0.05vsthe previous time point

圖1 免疫熒光檢測龍血素A作用的MCF-7細胞中Ki67的表達,×200

圖2 免疫印跡檢測龍血素A作用于MCF-7細胞中Bax和Bcl-XL/S蛋白的表達

圖3 流式細胞儀檢測龍血素A作用于MCF-7細胞的凋亡

3 討論

龍血素A是龍血竭中一種黃酮類化合物,屬于二氫查爾酮類化合物,是龍血竭中的主要活性成分,在龍血竭的活血化瘀[3]、抗菌[4]、抗血小板[5]、改善肝纖維化[6]作用中占主導(dǎo)地位。另龍血素A還有抗腫瘤的作用[1]。本實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,MTT法檢測藥物組細胞的增殖受到明顯抑制,且存在濃度及時間依賴性;免疫熒光顯示藥物組Ki67的表達顯著減少;免疫印跡顯示藥物組Bax的表達明顯增加,Bcl-XL/S的表達明顯減少;流式細胞儀檢測藥物組細胞的凋亡率高于對照組。表明龍血素A對體外培養(yǎng)的人乳腺癌MCF-7細胞具有抑制增殖和促進凋亡的作用。分析原因可能與以下因素有關(guān)。乳腺癌的發(fā)生是由多因素參與的細胞增殖和分化異常以及凋亡異常的過程,其中腫瘤細胞凋亡異常在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用,即癌基因和抑癌基因的異常激活和癌細胞凋亡異常引起腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]。其次包括Bcl-2、Bcl-xl、Bax、Bcl-xs在內(nèi)的凋亡蛋白受到一系列死亡信號的刺激后,可誘導(dǎo)細胞凋亡;并同時死亡信號的刺激(并)誘導(dǎo)Bax聚合在線粒體膜上與Bcl-xl形成異源二倍體加速細胞凋亡[8]。已知caspase-3作為級聯(lián)反應(yīng)下游最關(guān)鍵的執(zhí)行者,Bax既可作為capase-3的上游調(diào)控因子對capase-3活性進行調(diào)節(jié)[9],又可作為capase-3的直接底物對capase-3的下游進行調(diào)節(jié)。國內(nèi)外研究表明黃酮類化合物對乳腺癌[10]、卵巢癌[11]、前列腺癌[12]等激素依賴性腫瘤具有一定的防治作用。它們有的通過caspase信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)人惡性膠質(zhì)細胞T98G及U87MG凋亡[13],有的通過線粒體及死亡受體轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)人肝癌細胞SMMC-7721凋亡[14]。且龍血竭也已證明可通過線粒體途徑[15]或P53途徑[16]發(fā)揮抗腫瘤的作用。本實驗龍血素A作用MCF-7細胞,使Bax的表達明顯增加,Bcl-XL/S的表達明顯減少,結(jié)果與上述文獻相符。Ki67的表達受細胞周期變化的影響,被廣泛用作檢測細胞增殖的理想標志物之一。本實驗中藥物組Ki67表達顯著減少,提示Ki67可能參與了龍血素A抑制細胞增殖作用,實際情況有待進一步實驗驗證。

綜上所述,龍血素A對體外培養(yǎng)的人乳腺癌MCF-7細胞具有抑制增殖和促進凋亡的作用,推測可能與龍血素A可激活Bax/Bcl-xl線粒體信號通路而誘導(dǎo)乳腺癌細胞凋亡有關(guān),其細節(jié)尚需進一步研究