王趙偉 吳承龍 謝建平 肖桂榮 鐘芳芳

多發(fā)性硬化是臨床上常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病，目前缺乏特效藥[1]。沙利度胺可用于多發(fā)性骨髓瘤，且價格低廉[2-3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)它在自身免疫性疾病中具有應(yīng)用前景[4-5]。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）大鼠是最為常用的多發(fā)性硬化動物模型。筆者前期EAE模型的動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沙利度胺對于改善大鼠EAE發(fā)病期癥狀具有一定的作用[6]，但關(guān)于具體作用機(jī)制還不明確。已知EAE發(fā)病時中樞髓鞘脫失、軸突損傷和預(yù)后的關(guān)系極為密切，為進(jìn)一步明確沙利度胺對減輕EAE大鼠中樞髓鞘、軸突損傷的作用以及CD4+T細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制，筆者作了本研究，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 11～12周齡雄性SD大鼠30只，體重160～180g；10～12周齡豚鼠10只，雌雄不拘，均購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司；堅牢藍(lán)（LFB）染液（貨號：G1030）、甘氨酸銀染色試劑盒（貨號：G1052）均購自武漢塞維爾生物科技有限公司；沙利度胺（貨號：T144-1G）、完全弗氏佐劑（貨號：F5881-6X10ml）均購自美國Sigma-Aldrich公司；熒光標(biāo)記的CD3（貨號：12-0030-82）、CD4抗體（貨號：17-0040-82） 均購自美國 eBioscience公司。Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）凋亡檢測試劑盒（貨號：70-AP101-60）購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司。小鼠抗大鼠CD4（貨號：sc-53041）、GFAP一抗（貨號：sc-33673）、小鼠IgG kappa結(jié)合蛋白偶聯(lián)辣根過氧化物酶（m-IgGκBP-HRP；貨號：sc-516102-CM）均購自圣克魯斯生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與建模 將SD大鼠分成3組（即空白對照組、模型組、藥物組），每組10只。模型組與藥物組采用皮下注射豚鼠脊髓勻漿方法制作EAE模型[7]。將豚鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉并用0.9%氯化鈉溶液左心室灌注處死，獲得新鮮脊髓組織混入等量0.9%氯化鈉溶液后充分勻漿；再混入等量完全弗氏佐劑，用注射器抽打成油包水乳劑。將新鮮制成乳劑皮下注射于SD大鼠四肢足墊（0.4ml/只），即刻以及48h后分別腹腔注射一次百日咳毒素（1ml/次）。以EAE造模日計為第0天。而空白對照組僅注射0.9%氯化鈉溶液。

1.2.2 沙利度胺給藥 沙利度胺經(jīng)二甲基亞砜溶解后用0.9%氯化鈉溶液稀釋，終溶液二甲基亞砜濃度為2%，沙利度胺濃度為90mg/ml。藥物組大鼠從第0天開始腹腔注射給藥，連續(xù)15d，1次/d，每次劑量按60mg/kg計?？瞻讓φ战M、模型組僅腹腔注射不含沙利度胺的溶劑。

1.2.3 髓鞘及軸突特殊病理染色 第20天將SD大鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉，利用0.9%氯化鈉溶液左心室灌注處死。脊髓組織用40g/L多聚甲醛中固定。經(jīng)脫水、透明、浸蠟制成蠟塊，切片用于后續(xù)染色。LFB染色：石蠟切片，脫蠟至水；LFB染液60℃水浴預(yù)熱30min，切片浸染3～4h；切片冷卻10～15min，自來水洗；切片，70%乙醇、碳酸鋰溶液中交替分化，光鏡下控制分化程度，自來水洗；脫水、封片。甘氨酸銀染色：石蠟切片，脫蠟至水；切片在酸性甲醛浸泡5min，蒸餾水洗3次；37℃預(yù)熱的甘氨酸銀液浸泡3～5min；甩掉甘氨酸銀液，放入還原液Ⅰ數(shù)秒；切片，放入還原液Ⅱ數(shù)秒，蒸餾水洗；5%硫代硫酸鈉處理，蒸餾水洗3次；脫水、封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理變化。

1.2.4 免疫組化染色 組織切片經(jīng)烤片、脫蠟、水化后，在0.01M檸檬酸緩沖液中高壓鍋加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS 洗滌 3 次；滴加 CD4（1∶400）或 GFAP 一抗（1∶300），4℃過夜，PBS 洗滌 3 次；滴加 m-IgGκBP-HRP（1∶100）孵育120min，PBS洗滌3次；滴加DAB工作液，光鏡下控制顯色時間，去離子水洗滌，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。用PBS代替一抗作為陰性對照。每張切片隨機(jī)取3個高倍視野（400倍）觀察陽性細(xì)胞形態(tài)、分布，并計算CD4+T細(xì)胞數(shù)量[8]。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血CD4+T細(xì)胞凋亡情況 第20天取尾靜脈血0.5ml，經(jīng)紅細(xì)胞裂解液處理獲得白細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107/ml；用移液器分別吸取1μl CD3、1.25μl CD4熒光標(biāo)記抗體于EP管，冰上孵育30min；每管加入2ml染色緩沖液洗滌 2次；移取 5μl Annexin Ⅴ和 10μl PI；室溫孵育 5min，立刻（BD FACSAria）檢測外周血CD4+T細(xì)胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 14.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnet-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EAE發(fā)病期髓鞘及軸突損傷比較 LFB染色：空白對照組脊髓組織未見明顯髓鞘脫失，而模型組、藥物組均有髓鞘片狀脫失。其中藥物組髓鞘脫失多為局部小片狀，很少有大片髓鞘脫失，而模型組以大片髓鞘脫失多見。甘氨酸銀染色：空白對照組軸突被染成黑色，分布均勻，未見局部丟失；模型組、藥物組均可見軸突丟失，其中模型組軸突密度低于藥物組，見圖1。

圖1 EAE發(fā)病期髓鞘及軸突損傷比較（a：藥物組，LFB染色，×400；b：模型組，LFB 染色，×400；c：空白對照組，LFB 染色，×400；d：藥物組，甘氨酸銀染色，×1000；e：模型組，甘氨酸銀染色，×1000；f：空白對照組，甘氨酸銀染色，×1 000）

2.2 EAE發(fā)病期星形膠質(zhì)細(xì)胞增生比較 與空白對照組比較，模型組、藥物組星形膠質(zhì)細(xì)胞均有增生，其中藥物組星形膠質(zhì)細(xì)胞增生反應(yīng)較模型組輕，細(xì)胞體積也相對較小，見圖2。

圖2 EAE發(fā)病期星形膠質(zhì)細(xì)胞增生比較（a：藥物組；b：模型組；c：空白對照組；×400）

2.3 EAE發(fā)病期外周血T細(xì)胞及凋亡CD4+T細(xì)胞比例的比較 與模型組比較，藥物組CD4+T細(xì)胞比例明顯降低，凋亡CD4+T細(xì)胞比例明顯增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；而CD3+T細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 EAE發(fā)病期外周血T細(xì)胞及凋亡CD4+T細(xì)胞比例的比較（%）

2.4 EAE發(fā)病期脊髓CD4+T細(xì)胞浸潤程度比較 空白對照組未發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞浸潤，而藥物組CD4+T細(xì)胞浸潤較模型組明顯減輕，見圖3。進(jìn)一步作半定量分析，藥物組 CD4+T 細(xì)胞數(shù)為（179.1±55.23）個/mm2，明顯少于模型組的（259.8±61.55）個/mm2，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 EAE發(fā)病期脊髓CD4+T細(xì)胞浸潤程度比較（a：藥物組；b：模型組；c：空白對照組；×400）

3 討論

一般認(rèn)為，脫髓鞘疾病在炎癥后可通過少突膠質(zhì)細(xì)胞再生進(jìn)行修復(fù)，神經(jīng)功能可能達(dá)到基本恢復(fù)。若多發(fā)性硬化病情較重或反復(fù)發(fā)病，多數(shù)會遺留明顯的神經(jīng)缺損癥狀，造成較重的疾病負(fù)擔(dān)[9]。神經(jīng)功能的永久性缺損與軸突的不可逆損傷有關(guān)[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)沙利度胺治療EAE大鼠，不僅能減輕中樞髓鞘的脫失，還能減少軸突的丟失，表明沙利度胺具有潛在改善疾病預(yù)后的作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞內(nèi)重要的免疫調(diào)控細(xì)胞，對于維持中樞免疫平衡、營養(yǎng)神經(jīng)元具有重要意義[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，沙利度胺可以抑制中樞炎癥過程中星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生，減輕炎癥反應(yīng)。而星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎性增生反應(yīng)是EAE發(fā)病嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物。另一方面，本研究也提示沙利度胺可能通過調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞最終減輕髓鞘及軸突損傷，從而抑制EAE發(fā)病。在發(fā)病過程中，外周CD4+T細(xì)胞可由軟腦膜侵襲至中樞組織，從而引起炎癥反應(yīng)[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)沙利度胺可抑制發(fā)病高峰期過度增生的外周CD4+T細(xì)胞。此外，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)沙利度胺可促進(jìn)外周CD4+T細(xì)胞凋亡，降低外周CD4+T細(xì)胞比例。進(jìn)一步作免疫組化染色證實(shí)，沙利度胺可抑制中樞CD4+T細(xì)胞浸潤。可見，沙利度胺可能通過促進(jìn)外周CD4+T細(xì)胞凋亡，從而抑制細(xì)胞向中樞浸潤，最終減少髓鞘脫失及軸突損傷。

但是，關(guān)于確切的凋亡調(diào)控機(jī)制尚不明確。目前認(rèn)為沙利度胺可以抑制腫瘤血管的增生，具有調(diào)控血管再生的功能[15]。而多發(fā)性硬化、EAE發(fā)病過程中存在血管炎癥反應(yīng)，既有血管內(nèi)皮的損傷、血腦屏障的破壞，又有炎性血管增生的存在[16-17]。沙利度胺可能通過調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞生物反應(yīng)，從而影響外周CD4+T細(xì)胞向中樞浸潤。關(guān)于沙利度胺對血腦屏障的調(diào)控作用有待進(jìn)一步研究明確。

綜上所述，沙利度胺可減輕EAE大鼠發(fā)病過程中髓鞘脫失及軸突損傷，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞過度炎癥反應(yīng)，對于改善疾病預(yù)后具有一定作用。沙利度胺的免疫調(diào)控機(jī)制可能與促進(jìn)外周CD4+T細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞向中樞浸潤有關(guān)。