杜權(quán) 董曉巧 俞文華 朱強 車志豪 王昊 楊定博 沈永鋒 江力

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率高，預后不佳[1-3]。晝夜節(jié)律紊亂與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4-5]。時鐘基因編碼的蛋白質(zhì)可以調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律[6-7]。研究表明，時鐘基因啟動子區(qū)甲基化可以改變目的基因表達狀態(tài)，從而影響腦膠質(zhì)瘤的生長[8-10]。NPAS2時鐘基因?qū)儆谝职┗?，其蛋白表達低水平與結(jié)直腸癌預后不良相關(guān)[11]，也預示著腦膠質(zhì)瘤患者生存期縮短[12]。NPAS2時鐘基因啟動子區(qū)甲基化可以降低基因相關(guān)蛋白表達，參與帕金森病的發(fā)生、發(fā)展[13]。本研究通過檢測腦膠質(zhì)瘤NPAS2時鐘基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)，進而分析其與患者臨床特征及預后的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2005年6月至2010年6月本院行手術(shù)治療的102例初發(fā)腦膠質(zhì)瘤患者為研究對象。其中男63例，女39例；年齡＞60歲42例，≤60歲60例；WHO分級：Ⅰ～Ⅱ級49例，Ⅲ～Ⅳ級53例；腫瘤部位：幕上86例，幕下16例；腫瘤全切除72例；術(shù)后輔助化療56例；術(shù)后輔助放療77例；腫瘤類型：星形細胞瘤68例，其他34例；腫瘤直徑＞5cm 32例，≤5cm 70例；術(shù)前卡氏評分（KPS）＜80分60例，≥80分42例。所有患者均為漢族人，均未合并其他惡性腫瘤，其直系親屬均無膠質(zhì)瘤病史。

1.2 指標檢測 術(shù)中獲取腦膠質(zhì)瘤組織及癌旁正常組織，采用甲基化特異性PCR檢測NPAS2時鐘基因啟動子甲基化狀態(tài)。使用DNA組織提取試劑盒（規(guī)格250次，批號Z3105，美國Promega公司）提取基因組DNA，使用甲基化特異性PCR試劑盒（規(guī)格60次，批號EM101，美國Millipore公司）對基因組DNA進行亞硫酸氫鈉修飾，修飾后的DNA進行PCR擴增。時鐘基因的引物參照文獻[13]，產(chǎn)物于4%瓊脂糖凝膠上進行電泳，在紫外儀下觀察并記錄結(jié)果。為了確定甲基化特異性PCR檢測結(jié)果，以甲基轉(zhuǎn)移酶處理的基因組DNA作為陽性對照，未經(jīng)處理的基因組DNA作為陰性對照。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。利用Kaplan-Meier法繪制生存曲線并計算患者5年總生存期，生存期以表示，采用log-rank檢驗分析生存差異；采用Cox比例風險回歸模型分析影響5年總生存期的獨立危險因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 腦膠質(zhì)瘤組織與癌旁正常組織NPAS2時鐘基因啟動子區(qū)甲基化頻率比較 腦膠質(zhì)瘤組織NPAS2時鐘基因啟動子區(qū)甲基化頻率為19.6%（20/102），與其癌旁正常組織甲基化頻率5.9%（6/102）比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=8.64，P＜0.05）。

2.2 腦膠質(zhì)瘤組織NPAS2時鐘基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與臨床特征的關(guān)系 腦膠質(zhì)瘤組織NPAS2時鐘基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤類型、腫瘤直徑、術(shù)前KPS、腫瘤全切除、術(shù)后輔助放化療等均無關(guān)（均P＞0.05）；但與WHO分級有關(guān)，Ⅲ～Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤組織NPAS2時鐘基因啟動子區(qū)甲基化頻率明顯高于Ⅰ～Ⅱ級腦膠質(zhì)瘤組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表 1。

表1 腦膠質(zhì)瘤組織NPAS2時鐘基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與臨床特征的關(guān)系[例（%）]

2.3 腦膠質(zhì)瘤組織NPAS2時鐘基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與5年總生存期的關(guān)系 腦膠質(zhì)瘤患者5年總生存期為（30.4±2.0）個月，生存曲線見圖1?；颊?年總生存期與其腫瘤直徑、術(shù)前KPS、WHO分級、腫瘤全切除、術(shù)后輔助放化療、腦膠質(zhì)瘤組織NPAS2時鐘基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)均有關(guān)（均P＜0.05），與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤類型均無關(guān)（均P＞0.05），見表2。

2.4 影響5年總生存期的因素 經(jīng)Cox比例風險回歸模型分析，腫瘤全切除與否（HR=0.585，95%CI：0.353～0.969，P＜0.05）、腫瘤直徑（HR=1.970，95%CI：1.196～3.243，P＜0.05）、WHO 分級（HR=1.786，95%CI：1.110～2.874，P＜0.05）、腦膠質(zhì)瘤組織NPAS2時鐘基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)（HR=2.115，95%CI：1.223～3.656，P＜0.05）是影響患者5年總生存期的獨立危險因素。

圖1 腦膠質(zhì)瘤患者的生存曲線

表2 腦膠質(zhì)瘤患者5年總生存期比較

3 討論

晝夜節(jié)律是一種普遍的自然現(xiàn)象，它的存在使生物體的生理、生化、行為等生命現(xiàn)象表現(xiàn)為以24h為周期的振蕩。晝夜節(jié)律發(fā)生的物質(zhì)基礎是分子計時器，即晝夜節(jié)律生物鐘。它是由一組特異的核心元件組成，包括Clock、Bmal1、Pers、Crys、Tim 等基因及其相關(guān)蛋白產(chǎn)物。生物節(jié)律的基本分子機制是這些核心元件構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄-翻譯負反饋環(huán)。這個機制本質(zhì)上是內(nèi)源性的，但同時會受環(huán)境信號的導引，尤其是光信號。哺乳動物的主生物鐘被定位在下丘腦視交叉上核，當它受到異常刺激后，機體的晝夜節(jié)律可發(fā)生改變，嚴重時會引發(fā)疾病。到目前為止，維持生物鐘運行的確切分子調(diào)控過程尚未清楚[4-7]。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與晝夜節(jié)律系統(tǒng)的紊亂密切相關(guān)，時鐘基因可能通過復雜的網(wǎng)絡調(diào)節(jié)系統(tǒng)來影響腫瘤細胞的增生或凋亡[8-12]?；騿幼訁^(qū)甲基化是時鐘基因蛋白表達功能改變的重要方式[13]。Per1、Per2、Cry1、Cry2、Clock、Bmal1和NPAS2等時鐘基因的甲基化與胃癌、肝癌和乳腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[14-16]。關(guān)于時鐘基因甲基化的研究是目前腫瘤研究的熱點，明確某些時鐘基因的甲基化狀態(tài)有助于研究個體化的治療手段，從而提高惡性腫瘤的治愈率。

NPAS2是晝夜節(jié)律系統(tǒng)中重要的時鐘基因，是腫瘤抑制基因[11]。NPAS2蛋白可以抑制體外培養(yǎng)的癌細胞生長，NPAS2的表達水平與結(jié)直腸癌病理分級和預后密切相關(guān)[11]。高級別膠質(zhì)瘤NPAS2表達明顯下降，NPAS2高表達膠質(zhì)瘤患者生存期明顯延長[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤組織和癌旁正常組織NPAS2基因啟動子區(qū)均有甲基化，而膠質(zhì)瘤組織甲基化頻率明顯升高。本研究進一步分析發(fā)現(xiàn)，NPAS2時鐘基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤類型、腫瘤全切除、術(shù)后輔助放化療、腫瘤直徑、術(shù)前KPS等均無關(guān)，但與WHO分級有關(guān)，膠質(zhì)瘤組織WHO分級越高，NPAS2時鐘基因啟動子區(qū)甲基化頻率越高。生存分析結(jié)果提示，除腫瘤全切除、WHO分級、腫瘤直徑外，NPAS2時鐘基因啟動子區(qū)甲基化也是影響腦膠質(zhì)瘤患者5年總生存期的獨立危險因素?？紤]原因是NPAS2時鐘基因啟動子區(qū)甲基化可能會使NPAS2蛋白表達減少，從而解除對腦膠質(zhì)瘤生長的抑制，促進腦膠質(zhì)瘤的發(fā)展，最終影響患者的臨床預后。

綜上所述，NPAS2時鐘基因啟動子區(qū)甲基化可能參與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展，其甲基化程度與腦膠質(zhì)瘤惡性程度呈正相關(guān)，也是影響患者長期生存的危險因素。臨床檢測腦膠質(zhì)瘤組織NPAS2時鐘基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)，有利于分析和預測患者的臨床預后，同時協(xié)助腦膠質(zhì)瘤惡性程度分級，指導臨床進一步治療。