吳英樂，李廣平，何 蓉，李 健，董平栓

西洛他唑(cilostazol)是一種抗血小板聚集藥物，最初是作為治療間歇性跛行的藥物，于1999年被美國FDA批準上市，其藥理活性成分為其代謝產物3，4-二氫-西洛他唑和4’-順式-羥基-西洛他唑，其通過高效選擇性抑制磷酸二酯酶(phosphodiesterase, PDE)Ⅲ的活性，維持腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase, AC)活性，防止AC降解，使具有抗血小板聚集、擴張血管等作用的環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)含量升高[1]，達到抗血小板聚集及防止血管堵塞的目的。在治療慢心率房顫、病竇綜合征及二度Ⅰ型房室傳導阻滯的過程中，研究者發(fā)現(xiàn)西洛他唑可使心率有所提升，可明顯改善心臟的自律性[2-7]。也有研究認為給予Brugada綜合征患者西洛他唑藥物治療后，室顫的發(fā)生概率顯著降低[8]，而具體機制并不清楚。本研究通過不同給藥方式，給予大鼠西洛他唑，監(jiān)測大鼠心肌細胞瞬間外向鉀電流(Ito)以及其L型鈣離子流(ICa-L)的變化，探討該藥物在治療心律失常方面的作用。

1 對象及方法

1.1對象

1.1.1實驗動物清潔級健康雄性Spraque-Dawley大鼠(北醫(yī)動物中心)20只，體質量300～350 g。

1.1.2實驗分組雄性SD大鼠隨機分組：對照組10只，正常喂養(yǎng)3～4周；觀察組10只，在正常喂養(yǎng)基礎上，使用灌胃法給予西洛他唑每日10 mg·kg-1(西洛他唑正常成人常規(guī)用量為100 mg·d-1，按照等效劑量換算，大鼠用量約為10 mg·kg-1)，喂養(yǎng)3～4周。

1.2單個細胞分離方法

1.2.1溶液配制500 mL無鈣臺式液：10倍臺式液母液50 mL，1 360 mM NaCl母液50 mL，HEPES 1.192 g，Glucose 0.901 g，pH值7.40(NaOH)，50 mL無鈣液2份、冷藏/凍存。 100 mL KB液：母液10 mL，Taurine 0.125 g，L-Glutamic Acid 1.029 9 g，EGTA 0.38 g，Glucose 0.18 g，pH用KOH調至7.40，后加入BSA 0.5 g。生理臺式液500 mL：母液50 mL，1 360 mM NaCl 50 mL、HEPES 1.192 g、Glucose 0.901 g，1 M CaCl20.9 mL，pH用NaOH調至7.40。60 mL酶液：膠原酶Ⅱ0.02 g(worthington)、BSA 0.12 g、50 mM CaCl20.1 mL (Ca2+濃度50～80 μM)，定容。西洛他唑(cilostazol)溶于二甲亞砜配制成母液，使用時再次稀釋，西洛他唑濃度分別達到2 μmol·L-1及50 μmol·L-1。西洛他唑在人體內環(huán)境可達的最大血藥濃度為2 μmol·L-1。

1.2.2心室肌細胞分離采用膠原酶Ⅱ酶解法：喂養(yǎng)3～4周后的兩組大鼠使用10%水合氯醛300 mg·kg-1腹腔注射麻醉后開胸取心，主動脈插管，在通100%O2條件下進行灌流。依次用無鈣臺氏液(5～6 min )、含0.033%膠原酶Ⅱ(worthington)的無鈣臺式液(13～15 min)進行灌流。之后，取右心室心肌組織，將其置于KB溶液中剪碎、吹打并過濾，將濾出液用KB液稀釋2倍后進行離心，后將細胞沉渣以KB液稀釋至40 mL，置于50 mL小燒杯中，室溫靜置1h備用。高質量的單細胞標本可供8～12 h的膜片鉗實驗。

1.3心肌細胞離子通道記錄方式①將大鼠右心室肌單細胞標本導入灌流池，使用膜片鉗技術記錄兩組大鼠的心室肌細胞的Ito和ICa-L。②將濃度為50 μmol·L-1或2 μmol·L-1的Cilostazol溶液注入細胞外灌流液，進行灌流—洗脫實驗，記錄給藥及洗脫后的Ito離子通道的變化。

1.4心肌細胞離子通道記錄方案①Ito：鉀電流電極內液及NMDG無鈉液為細胞外液。HP：-40 mV失活鈉電流，TP：-50 mV～+60 mV，階躍+10 mV，Time 300 ms，刺激0.5 Hz，采樣20 kHz，低通濾波頻率5 kHz。②ICa-L記錄方案：鈣電流電極內液及生理臺式液為細胞外液，HP：-40 mV，TP-50 mV～+60 mV，階躍+10 mV，Time 200 ms，刺激0.2 Hz、采樣20 kHz，低通濾波頻率5 kHz，采用P/N漏減(n=4，濾波時間180 ms)。

2 結果

2.1急性藥理學試驗

2.1.150μmol·L-1西洛他唑對Ito的影響將濃度為50 μmol·L-1的西洛他唑加入灌流池，可以迅速阻滯大鼠心室肌的瞬間外向鉀電流(Ito)，3 min內達穩(wěn)態(tài)，洗脫藥物后，其可基本恢復到對照水平，見圖1。

2.1.250μmol·L-1西洛他唑灌流前后對Ito平均電流密度的Ⅰ～Ⅴ曲線的影響將50 μmol·L-1西洛他唑加入細胞外液后數(shù)分鐘的Ito變化(n=7)，與對照組相比，自指令電壓+10 mV至最大+60 mV測試電壓范圍內，西洛他唑灌流后瞬間外向鉀電流(Ito)電流密度均小于灌流前，且差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，n=7)，在+60 mV時，兩組Ito的電流密度分別為(21.55±2.61) pA/pF和(5.36±2.16) pA/pF(P<0.001)，自指令電壓+10 mV～+60 mV西洛他唑均可明顯抑制Ito，見圖2。

西洛他唑可逆性抑制Ito電流：A：給藥前Ito基線；B：50 μmol·L-1西洛他唑加入3 min；>西洛他唑灌流—洗脫實驗對一個大鼠右心室肌細胞(Cm=90 pF)Ito的影響

圖2 50 μmol·L-1西洛他唑灌流前后對Ito平均電流密度的Ⅰ～Ⅴ曲線的影響(n=7)

2.1.32μmol·L-1西洛他唑灌流前后對Ito的影響將濃度為2 μmol·L-1的西洛他唑加入灌流池，此濃度為成人口服常規(guī)劑量的西洛他唑可達到的最大血藥濃度，觀察到西洛他唑可以阻滯大鼠右心室肌的瞬間外向鉀電流(Ito)，2 min內達穩(wěn)態(tài)，藥物洗脫后，Ito可部分恢復到正常水平，見圖3。

A：給藥前Ito基線；B：2 μmol·L-1 西洛他唑加入2 min；C：洗脫9 min；D:曲線圖。圖3 2 μmol·L-1西洛他唑灌流—洗脫實驗對一個大鼠右心室肌細胞(Cm=140 pF)Ito的影響

2.1.42μmol·L-1西洛他唑灌流前后對Ito平均電流密度的Ⅰ～Ⅴ曲線的影響可見與對照組相比，自指令電壓+30 mV至最大+60 mV測試電壓范圍內，給予西洛他唑灌流后，大鼠右心室肌瞬間外向鉀電流(Ito)電流密度均小于灌流前，且均有統(tǒng)計學差異(P<0.05，n=5)，在+60 mV時，兩組電流密度分別為(18.64±7.89) pA/pF和(7.63±1.78) pA/pF(P=0.02)，自指令電壓+30 mV～+60 mV西洛他唑均可明顯抑制Ito，見圖4。

2.2西洛他唑對離子通道的影響

2.2.1西洛他唑對Ito的影響舉例繪制觀察組Ito電流圖樣，見圖5。

圖4 2 μmol·L-1西洛他唑灌流前后對Ito平均電流密度的Ⅰ～Ⅴ曲線的影響(n=5)

A：對照組(Cm=90 pF) ，B：觀察組(Cm=100 pF)。圖5 舉例Ito電流圖樣

2.2.2西洛他唑對Ito平均電流密度的Ⅰ～Ⅴ曲線的影響在+60 mV時，對照組Ito電流密度為(20.23±5.64) pA/pF，觀察組為(21.74±8.56) pA/pF，P>0.05，兩組Ⅰ～Ⅴ曲線無統(tǒng)計學差異，見圖6。

2.2.3西洛他唑對L型鈣電流(ICa-L)的影響舉例繪制對照組及觀察組ICa-L電流圖樣，見圖7。

圖6 對照組及觀察組Ito平均電流密度的Ⅰ～Ⅴ曲線

A: 對照組(Cm=90pF)；B：觀察組(Cm=100pF)。 圖7 舉例ICa-L電流圖樣

2.2.4西洛他唑對ICa-L平均電流密度的Ⅰ～Ⅴ曲線的影響在+10 mV時，對照組ICa-L電流密度為(-6.24±2.64) pA/pFh，觀察組為(-5.18±1.35) pA/pF，西洛他唑對兩組大鼠心肌的L-型鈣通道電流(ICa-L)的Ⅰ～Ⅴ曲線的影響無統(tǒng)計學差異，(P>0.05)，見圖8。

圖8 對照組及觀察組ICa-L平均電流密度的Ⅰ～Ⅴ曲線

3 討論

Antzelevitch等[9-12]提出了2相折返(phase 2 reentry)的概念，研究提示室性心律失常可由2相折返引起，即心肌動作電位平臺期局部電流可引起折返激動而誘發(fā)心律失常。Ito在心外膜和心肌層的密度比心內膜高，當Ito在心肌的這種異質分布因某種病理因素或藥物的干預而出現(xiàn)變化時，引起心肌電異質性的增加，心外膜細胞動作電位圓頂消失、時程縮短、平臺期消失，進而導致心室肌跨壁復極離散度增大，導致2相折返。目前研究認為Brugada綜合征、特發(fā)性室速及心肌缺血再灌注性心律失常等多種心律失常均可能與2相折返關系密切。

在對Brugada綜合征的研究中發(fā)現(xiàn)，心肌細胞內膜和外膜的Ito密度差異顯著，外膜Ito密度顯著高于心內膜，使得其電壓梯度差增加，導致跨壁電流形成，反映在心電圖上呈J波和J點抬高，ST段抬高。而后形成跨壁折返微環(huán)路正是由跨壁局部電流的作用導致局部的心肌細胞興奮，外膜層細胞再次激動即2相折返，誘導惡性心律失常的發(fā)生。然而在目前的臨床治療中，對此類惡性心律失常唯一可靠的治療方法仍是安置植入型除顫儀，相關藥物治療的研究進展相對緩慢。理論上，通過減少Ito離子通道電流或增強ICa-L增加內向電流，抑制2相折返的發(fā)生，即可維持心外膜動作電位的正常形態(tài)[8,13-14]，達到預防此類惡性心律失常發(fā)生的目的。

有研究表明Brugada綜合征患者的惡性心律失?？梢员晃髀逅蛴行У仡A防[8,15]，其機制可能是：①在起搏細胞中，ATP和腺嘌呤衍生物有潛在的增強負性變時作用，西洛他唑有提升心率的正性變時作用，其機制是使心肌細胞對腺苷攝取減少，在此基礎上有效抑制了瞬間外向鉀電流(Ito)。②瞬間外向鉀電流(Ito)被抑制后，緊隨其之后開放的離子通道都會延遲開放，達到延遲ADP的作用。③細胞內的磷酸二酯酶(PDE)Ⅲ的活性可被西洛他唑選擇性抑制，PDEⅢ降解AC的作用減弱，維持細胞內較高的cAMP濃度又可通過cAMP/PKA通路增強鈣離子電流；同時通過提升心率抑制Ito，也可以增強竇房結的ICa-L(8)。綜上，西洛他唑一方面抑制 Ito，另一方面增強ICa-L，維持心肌動作電位同質性，預防2相折返的發(fā)生，預防此類惡性心律失常的發(fā)生。

但國內外對于使用膜片鉗技術觀察西洛他唑對Ito和ICa-L影響的相關報道較少。本實驗通過急性藥理試驗(灌流—洗脫實驗)，利用全細胞膜片鉗技術，監(jiān)測Ito和ICa-L在西洛他唑影響下的變化情況，結果證明將濃度為50 μmol·L-1及2 μmol·L-1的西洛他唑加入細胞外灌流液，均可明顯降低Ito的幅度值。分別由給藥前的(21.55±2.61) pA/pF降至(5.36±2.16) pA/pF，及給藥前的(18.64±7.89) pA/pF降至(7.63±1.78) pA/pF，差異均有統(tǒng)計學意義。且西洛他唑洗脫后，Ito幅值均可恢復，證明大鼠心室肌細胞Ito的幅值大小可直接受到西洛他唑的影響。其機制可能是直接作用于離子通道(降低活性、減少數(shù)量)，改變其生物學功能。這說明西洛他唑通過抑制心肌細胞對腺苷的攝取，在提升心率的同時抑制Ito，只是其抑制Ito的繼發(fā)原因之一。而由于大鼠右心室肌ICa-L自身衰減較快，且用全細胞膜片鉗記錄ICa-L通道所用的電極內液具有細胞毒性，不能確切記錄西洛他唑對離子通道的影響，故本實驗未通過急性藥理試驗來觀察西洛他唑對大鼠右心室肌ICa-L的影響。

本實驗結果顯示，觀察組與對照組相比，兩組Ito及ICa-L差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。分析可能是因為：①數(shù)據(jù)樣本量不足，數(shù)據(jù)可能存在一定不穩(wěn)定性，存在假陰性的可能。②藥物作用于離子通道，改變其生物學功能，發(fā)揮其調控作用，是一個長期慢性的過程。本實驗給予藥物時間為3至4周，可能給藥時間不足夠長久，離子通道未發(fā)生顯著的功能變化。③急性藥理試驗西洛他唑加入細胞外灌流液，直接作用于大鼠心肌細胞，影響其離子通道的開放；臨床上患者口服用藥在藥物效能和作用時間上均達不到基礎實驗中直接作用于心肌細胞的效果，存在較大的差異性，因此仍需要大量臨床及基礎研究驗證和探討。

本研究存在一些局限性：①數(shù)據(jù)樣本量不足，結論誤差大，不排除假陰性的可能；②本實驗僅使用正常大鼠心室肌細胞來觀察西洛他唑對Ito和ICa-L離子通道的影響，未模擬心?；蛐穆墒С５葘嶒瀯游锬Ｐ停孕柽M一步完善。③本研究只觀察了西洛他唑對大鼠右心室肌Ito和ICa-L兩個離子通道的影響，探討其可能的抗心律失常作用，然而心房肌細胞的離子通道很可能另有特點，因此仍需要大量科學論據(jù)來論證西洛他唑對心肌細胞離子通道的影響和機制。

總之，本實驗證明將西洛他唑加入細胞外灌流液，使用膜片鉗技術觀察其直接作用于大鼠右心室肌細胞，可以抑制Ito，提示西洛他唑可能通過抑制Ito而恢復心肌動作電位平臺期和維持動作電位的同質性，從而抑制以2相折返為基礎惡性心律失常的發(fā)生。