鄭 皓，景嘉楠，李鐵鵬，董 慧，陳 卓，董子明

食管癌(esophageal cancer, EC)主要有食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma, EAC)，二者的病因?qū)W和病理學特征有很大的不同。西方國家的食管癌多以腺癌常見，而我國的食管癌則是以鱗癌為主[1-3]。我國是世界上食管癌高發(fā)的國家之一，每年食管癌新發(fā)病例超過22萬例，死亡超20萬例[4-5]。

細胞周期紊亂與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關。細胞周期由細胞周期蛋白(cyclins)、細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin dependent kinases, CDKs)、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白(cyclin dependent kinase inhibitor,CDKI)三者共同調(diào)節(jié)[6-8]。其中CDKs受Cyclins的正調(diào)控以及CDKI的負調(diào)控，CDKs的異常表達會引起細胞周期的紊亂，從而引起腫瘤發(fā)生[9-12]。

CDKs家族成員CDK7與CDK14不僅與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展有密切的關系，而且可以作為食管鱗癌的預后標志物以及化療反應的預測標志物[13-14]。研究表明，CDK16在多種腫瘤中高表達，并通過調(diào)控腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移以及凋亡，從而在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中發(fā)揮著重要作用[15-18]。

本研究利用組織芯片研究CDK16在正常食管黏膜、食管癌原發(fā)灶、食管癌轉(zhuǎn)移灶、陰性/陽性淋巴結以及32例食管鱗癌組織樣本中的表達，并探討CDK16在人食管癌組織中表達的意義，以推測CDK16在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1芯片組織芯片技術是指研究者將幾十個或更多病患的組織點排列且固定在1張切片上，同時研究某一種蛋白在這些樣本中的表達。實驗條件一致且一次完成，可以較大地提高實驗結果的可靠性[19-20]。本研究中所使用的2張食管癌組織芯片均是通過收集鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院(河南省腫瘤醫(yī)院)手術切除的組織標本制作而成。實驗共收集2016年3月至7月河南省腫瘤醫(yī)院手術切除的食管癌標本58例，男性45例，女性13例，年齡(70±8.77)歲。所有患者均符合食管鱗癌的診斷標準[衛(wèi)生部關于食管癌標準化診治指南(2011版)]，臨床病理資料完整且術前未接受任何放、化療。所有患者均知情同意。手術切除后立即取食管癌組織及相應遠端正常食管上皮組織在20～30 min內(nèi)快速冷凍在液氮罐中，并保存于-80 ℃冰箱。

為了研究方便，將這2張組織芯片分別命名為hESCC-TMA060和hESCC-TMA030。其中，hESCC-TMA060組織芯片上共有60個組織標本點，共包括3例正常食管黏膜、1例食管原位癌、17例食管鱗狀細胞癌的原發(fā)灶(癌/癌旁各1點)、9例食管鱗狀細胞癌的轉(zhuǎn)移灶、4例原發(fā)食管鱗狀細胞癌患者的陰性淋巴結、9例原發(fā)食管鱗狀細胞癌患者的陽性淋巴結。hESCC-TMA030組織芯片上共有30個組織標本點，共包括15例原發(fā)食管鱗狀細胞癌，每1例包括癌組織和癌旁組織各1點。兩張組織芯片上的所有組織標本點均勻排布于載玻片上，沒有脫片，也沒有明顯的位移或扭曲。組織芯片經(jīng)HE染色病理診斷證實。

1.1.2試劑兔抗人CDK16多克隆抗體購自英國Abcam公司。SP-9000免疫組化試劑盒購自北京中杉生物技術有限公司，包括封閉用山羊血清、生物素標記二抗和辣根酶標記鏈霉卵白素。EnVisionTM試劑盒和DAB顯色液均購自福州邁新生物技術公司，具體操作步驟參照試劑盒說明書。

1.2方法

1.2.1免疫組化首先，組織芯片經(jīng)脫蠟水化，3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶10 min。然后在0.1%枸櫞酸緩沖液(pH6.0～6.2)中微波修復20 min，山羊血清封閉15 min。4 ℃冰箱中一抗過夜。第2天芯片恢復室溫后，依次加入生物素化的二抗和辣根酶標記鏈霉卵白素，分別于37 ℃條件下孵育30 min。然后依次進行DAB顯色、蘇木素復染、梯度酒精脫水、二甲苯透明等步驟，最后用中性樹膠封片。陽性對照：卵巢癌中CDK16的免疫組化染色；陰性對照：使用PBS代替一抗的食管鱗癌免疫組化染色。

1.2.2結果判定首先由兩位經(jīng)驗豐富的病理學專家獨立閱片，然后討論分析，最終確定免疫組化結果。CDK16的陽性染色程度采用半定量計分方法判定結果。隨機任選10個視野(×400)，每個視野中100個腫瘤細胞，根據(jù)免疫組化染色強度及染色細胞所占比例這二者的乘積來判定。其中，染色強度以多數(shù)細胞的著色深淺來判定：不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；染色細胞所占比例：陽性細胞<5%為0分，陽性細胞占5%～25%為1分，陽性細胞占26%～50%為2分，陽性細胞占51%～75%為3分，陽性細胞>75%為4分。兩項評分相乘即得到最終的分數(shù)：0分為陰性，>0分則為陽性，其中1～3分為弱陽性(+)，4～8分為中陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)。

1.3統(tǒng)計學分析應用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件包進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。CDK16在食管鱗癌的癌組織及癌旁組織中表達的差異采用χ2檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1組織芯片染色的有效性hESCC-TMA060組織芯片上共有60個組織標本點，經(jīng)HE染色后，殘缺點數(shù)為0，有效信息量為100%；經(jīng)免疫組化染色后，殘缺點數(shù)為2，有效信息量為96.7%，見圖1。hESCC-TMA030組織芯片上共有30個組織標本點，經(jīng)HE染色后，殘缺點數(shù)為0，有效信息量為100%；經(jīng)免疫組化(immunohistochemistry, IHC)染色后，殘缺點數(shù)為0，有效信息量為100%，見圖1。

hESCC-TMA060組織芯片、hESCC-TMA030組織芯片的IHC染色及HE染色結果，其中IHC使用CDK16抗體。IHC：免疫組織化學；HE：蘇木精—伊紅染色。圖1 兩張組織芯片的IHC與HE染色結果

2.2CDK16在食管鱗癌病程組織中的表達免疫組化染色結果顯示，在正常食管黏膜中，CDK16未見表達，見圖2A；在食管原位癌中，CDK16呈弱陽性表達，見圖2B；在食管癌原發(fā)灶中CDK16陽性表達，且表達強度與腫瘤臨床分期正相關，見圖2C～F。

A：正常食管黏膜；B：食管原位癌；C：食管癌原發(fā)灶1期；D：食管癌原發(fā)灶2期；E：食管癌原發(fā)灶3期；F：食管癌原發(fā)灶4期(IHC，×200)。圖2 CDK16在食管鱗癌病程組織中的表達

2.3CDK16在食管癌轉(zhuǎn)移灶中的表達本研究中芯片所涉及的食管癌的轉(zhuǎn)移灶主要包括左肺下葉、右腎、左頸部、背及腰部皮下、空腸、小腸這6種。其中在左肺下葉轉(zhuǎn)移灶中，CDK16中陽性表達；在右腎轉(zhuǎn)移灶中，CDK16強陽性表達；在左頸部轉(zhuǎn)移灶中，CDK16則為弱陽性表達；在背及腰部皮下的轉(zhuǎn)移灶中，CDK16強陽性表達；在空腸轉(zhuǎn)移灶中，CDK16弱陽性表達；在小腸轉(zhuǎn)移灶中，CDK16弱陽性表達，見圖3。綜上，CDK16在食管癌轉(zhuǎn)移灶中呈陽性表達，但不同轉(zhuǎn)移部位的表達強度存在差異。

A：轉(zhuǎn)移到左肺下葉；B：轉(zhuǎn)移到右腎；C：轉(zhuǎn)移到左頸部；D：轉(zhuǎn)移到背及腰部皮下；E：轉(zhuǎn)移到空腸；F：轉(zhuǎn)移到小腸(IHC，×200)。圖3 CDK16在食管癌轉(zhuǎn)移灶中的表達

2.4CDK16在食管癌患者淋巴結中的表達實驗結果表明，在食管癌患者的陰性淋巴結細胞中，CDK16陰性表達，見圖4A；而在陽性淋巴結細胞中，CDK16呈強陽性表達，見圖4B。綜上，CDK16表達與食管癌的淋巴結轉(zhuǎn)移緊密相關。

A：陰性淋巴結；B：陽性淋巴結(IHC，×200)。圖4 CDK16在食管癌患者淋巴結中的表達

2.5CDK16在食管鱗癌中的表達及定位

本次研究中的兩張組織芯片共包括32例原發(fā)食管鱗狀細胞癌，每1例包括癌組織和癌旁組織各1點。結果表明，CDK16在這32例食管鱗癌的癌組織和癌旁組織中的陽性表達率分別為71.9%、37.5%，癌組織中CDK16的陽性表達率明顯高于癌旁組織(P<0.05)，見表1。腫瘤細胞的分化程度可反映腫瘤的分級與惡性程度。在本研究中，CDK16在高分化食管鱗癌細胞中為弱陽性表達；在中分化食管鱗癌細胞中中陽性表達；而在低分化食管鱗癌細胞中則為強陽性表達，見圖5。所以，CDK16在食管鱗癌中的表達與腫瘤分化程度呈負相關。

表1 CDK16在食管鱗癌中的表達(n=32)例(%)

注：皮爾遜卡方檢驗。

圖5 CDK16在不同分化程度食管鱗癌中的表達(IHC，×200)

在正常食管黏膜中，CDK16整體為陰性表達，但可見零星幾個細胞核呈陽性染色。這表明CDK16在正常食管黏膜中表達在細胞核，見圖6A(紅色箭頭)；在食管原位癌中，CDK16弱陽性表達，且主要表達在細胞核中，見圖6B；在食管鱗癌的高分化癌組織中，CDK16在細胞質(zhì)和細胞核中均有表達，但細胞核中的表達強度遠遠大于細胞質(zhì)中的表達強度，見圖6C；在食管鱗癌的中分化癌組織中，CDK16在細胞質(zhì)和細胞核中均有表達，且表達水平基本一致，見圖6D；在食管鱗癌的低分化癌組織中，CDK16在細胞質(zhì)和細胞核中均有表達，但在細胞質(zhì)中的表達要遠遠強于在細胞核中的表達，見圖6E；在陽性淋巴結中，CDK16在細胞質(zhì)和細胞核中均表達，細胞核中的表達要遠遠的強于在細胞質(zhì)中的表達，見圖6F。

A：正常食管黏膜；B：食管原位癌；C：高分化癌組織；D：中分化癌組織；E：低分化癌組織；F：陽性淋巴結(IHC，×400)。圖6 CDK16在食管鱗癌細胞中的定位

綜上，在食管鱗癌中，CDK16在腫瘤細胞的細胞質(zhì)和細胞核中均有表達，且總體表達水平隨著腫瘤的惡性程度而增強。其中CDK16在細胞核中的表達陽性強度隨著腫瘤的惡性程度依次遞減，而在細胞質(zhì)中的表達陽性強度隨著腫瘤的惡性程度依次遞增。

3 討論

食管鱗癌患者預后差、死亡率高，5 a生存率只有17%～20%[21-22]。細胞周期紊亂與食管鱗癌發(fā)生發(fā)展密切相關。細胞周期蛋白依賴性激酶家族成員與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的關系[23-24]。

CDK16也被稱為PCTAIRE1或PCTK1，屬于CDKs家族[25]。CDK16是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可在終末分化細胞中的信號轉(zhuǎn)導通路中發(fā)揮作用，同時在分泌型蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上運輸?shù)倪^程中發(fā)揮作用[26-27]。研究發(fā)現(xiàn)，CDK16在包括乳腺癌、甲狀腺癌、宮頸癌、卵巢癌、鼻咽癌及髓母細胞瘤等多種腫瘤中具有較高的表達。CDK16在這些腫瘤細胞中通過相應的信號轉(zhuǎn)導通路，在腫瘤細胞的生長、增殖、侵襲、遷移以及凋亡的過程中發(fā)揮著重要的作用[28-30]。但是CDK16在食管癌中的表達情況尚不明晰，也未見有相關的文獻報道。本課題組的研究重點是人消化系統(tǒng)腫瘤的發(fā)病機制，尤其是食管鱗癌發(fā)病的分子機制。因此，作者討論CDK16在食管癌中的表達及其意義。

本研究結果顯示，CDK16在正常食管黏膜中陰性表達，在食管癌原發(fā)灶中陽性表達。尤其值得關注的是，CDK16在食管鱗癌的癌組織中的表達強度與食管鱗癌的分化程度負相關。這些結果提示，CDK16在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的過程中發(fā)揮著重要的作用。另外本研究還發(fā)現(xiàn)，CDK16在食管癌患者的陰性/陽性淋巴結細胞中分別呈現(xiàn)陰性/陽性表達，且CDK16在食管鱗癌的轉(zhuǎn)移灶中也呈陽性表達。這就提示CDK16與食管鱗癌的淋巴結轉(zhuǎn)移有著密切的關系。

本研究表明，CDK16與食管鱗癌的發(fā)生關系密切，其異常表達可能是食管鱗癌發(fā)生的關鍵因素之一。檢測CDK16在食管鱗癌中的表達對食管鱗癌的臨床診斷具有一定的指導作用。本課題組后續(xù)將重點研究CDK16對食管鱗癌細胞各項生物學功能的影響，并探究CDK16調(diào)控食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的分子機制。