劉海英，高 遠(yuǎn)，邢晨濤，甄俊琦， 陸順麗，王玉芝

(河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007)

菊花(ChrysanthemumxmorifoliumRamat.)，為多年生宿根花卉，其頭狀花序色彩豐富，具有重要的觀賞價(jià)值[1]?；ㄇ嗨剀?Anthocyanidin)又稱(chēng)花色苷，是植物體內(nèi)的一種天然水溶性色素，主要存在于植物的果實(shí)、花、莖和葉中的液泡[2]，水果、蔬菜、花卉等五彩繽紛的顏色大部分都與之有關(guān)[3]?；ㄇ嗨剀赵谑称?、化妝品、醫(yī)藥等方面有著巨大的應(yīng)用前景[4-7]。菊花品種分為白色、黃色、橙色、粉色、紅色、紫色和綠色七大色系[8]，其中橙色、粉色、紅色和紫色4種色系菊花花色的形成均與花瓣中的花青素苷有關(guān)，尤其是紫色菊花，花瓣中花青素苷含量較高[9]。將菊花花瓣中的花青素苷進(jìn)行工業(yè)化提取，對(duì)于菊花產(chǎn)業(yè)鏈的延伸具有重要的意義。

目前，我國(guó)對(duì)于菊花的研究主要在其資源的調(diào)查、花期調(diào)控及產(chǎn)量品質(zhì)栽培學(xué)、菊花花青素苷合成關(guān)鍵基因表達(dá)與花色表型的關(guān)系，以及不同采收期對(duì)菊花產(chǎn)量和質(zhì)量的研究等方面[10-14]，有關(guān)花青素苷提取專(zhuān)用菊種質(zhì)及其適宜采收期篩選方面，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究選取橙色、粉色、紅色和紫色4個(gè)色系、7個(gè)品種菊花為供試材料，對(duì)其不同采收期的產(chǎn)量和品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，初步明確產(chǎn)量較高、品質(zhì)較好的品種及其適宜采收期，并進(jìn)一步利用該品種開(kāi)展不同采收期分批次采收試驗(yàn)，對(duì)初步研究結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證、完善和補(bǔ)充，以期為鑒定和選育花青素苷提取專(zhuān)用菊種質(zhì)及其高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試品種為4個(gè)色系、7個(gè)菊花品種，包括：小菊品種橙小菊(橙色)、粉小菊(粉色)、粉色思緒(粉色)、意大利紅(紅色)、紅五九(紫色)和大菊品種紫玉(紫色)和姹紫嫣紅(紫色)(河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院菊花圃種植)。在一般大田栽培方式管理下，5個(gè)小菊品種完全自然生長(zhǎng)，2個(gè)大菊品種紫玉和姹紫嫣紅僅保留主莖，不斷除去多余的腋芽，待花蕾出現(xiàn)后，通過(guò)不斷抹蕾，僅保留1朵頂生花蕾。

試驗(yàn)分為兩階段。第一階段：選取上述7個(gè)菊花品種代表性植株各3株，標(biāo)記首批進(jìn)入開(kāi)花狀態(tài)的頭狀花序，隨開(kāi)花進(jìn)程推進(jìn)設(shè)置7個(gè)采收期(Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期、Ⅵ期和Ⅶ期)，在每個(gè)采收期分別等數(shù)量采收標(biāo)記過(guò)的菊花頭狀花序。第二階段：在第一階段試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇小菊品種紅五九代表性植株12株，分成4組，在4個(gè)采收期分別按5個(gè)批次采收所有達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的菊花頭狀花序。采收的菊花頭狀花序用于產(chǎn)量和品質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定。

小菊品種7個(gè)采收期形態(tài)特征分別為：Ⅰ期，花序最外層顯色且花瓣微微張開(kāi)；Ⅱ期，花序最外層舌狀花花瓣展開(kāi)至豎立狀態(tài)；Ⅲ期，花序最外層舌狀花花瓣展開(kāi)至45°張角；Ⅳ期，花序最外層舌狀花花瓣完全伸展，中間管狀花集中部分全為黃色；Ⅴ期，花序最外層舌狀花花瓣完全伸展，中間管狀花區(qū)域黃色消失一半且雌蕊Y形柱頭突出；Ⅵ期，花序最外層舌狀花花瓣完全伸展，中間管狀花區(qū)域從外向內(nèi)1/2到2/3處黃色消失且雌蕊Y形柱頭突出；Ⅶ期，花序最外層舌狀花花瓣顏色變暗且略枯萎，中間管狀區(qū)域黃色全部消失且雌蕊Y形柱頭突出。大菊品種7個(gè)采收期形態(tài)特征分別為：Ⅰ期：花序從外向內(nèi)第一、二輪花瓣顯色且微微張開(kāi)，始花期；Ⅱ期：花序從外向內(nèi)第一、二輪花瓣顏色加深，體積膨大，張開(kāi)角度加大，從外向內(nèi)第三、四輪花瓣花序微微張開(kāi)，初花期；Ⅲ期：花序從外向內(nèi)第三、四輪花瓣張開(kāi)角度加大，內(nèi)層仍有數(shù)層花瓣未張開(kāi)，盛花前期；Ⅳ期：花序最外層花瓣完全伸展，露出中間管狀花集中部分且全為黃色，盛花中期；Ⅴ期：花序從外向內(nèi)第一、二輪花瓣邊緣略有萎蔫狀態(tài)，中間管狀花區(qū)域外圍一、二圈黃色消失且雌蕊Y形柱頭突出，盛花后期；Ⅵ期：花序從外向內(nèi)第三、四輪花瓣邊緣略有萎蔫狀態(tài)，中間管狀花區(qū)域從外向內(nèi)1/2～2/3處黃色消失且雌蕊Y形柱頭突出，開(kāi)花后期；Ⅶ期：全花序花瓣顏色變暗且呈萎蔫狀態(tài)，中間管狀區(qū)域黃色全部消失且雌蕊Y形柱頭突出，開(kāi)花末期。

1.2 儀器與試劑

儀器：UV-2600紫外分光光度計(jì)(島津企業(yè)管理中國(guó)有限公司)；723N可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司)；FA2004 電子分析天平(上海上平儀器有限公司)；PHSJ-3F實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)。

試劑：鹽酸(鄭州派尼化學(xué)試劑廠)；無(wú)水乙醇和檸檬酸(天津市德恩化學(xué)試劑有限公司)；乙酸鈉(天津興復(fù)科技發(fā)展有限公司)；冰乙酸(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；氯化鉀(上海振興試劑廠)；檸檬酸鈉和氫氧化鈉(天津市瑞金特化學(xué)品有限公司)；雙蒸水為河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控實(shí)驗(yàn)室制備。所有試劑均為分析純。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 單花序花瓣干質(zhì)量的測(cè)定 采集新鮮菊花頭狀花序舌狀花花瓣，先用濕紗布擦去表面灰塵，再用吸水紙吸干表面水分，將所有舌狀花花瓣從花序上取下，在40 ℃下鼓風(fēng)干燥72 h后稱(chēng)量花序舌狀花花瓣干質(zhì)量。將烘干后的舌狀花花瓣收集置于避光陰涼通風(fēng)處存放，用于花青素苷含量的檢測(cè)。

1.3.2 花青素苷含量的測(cè)定 采用pH示差法測(cè)定[15-17]。將體積分?jǐn)?shù)為80%的無(wú)水乙醇與0.1 mol/L的鹽酸溶液以1∶2的體積比混合，配制成花青素苷的浸提劑。準(zhǔn)確稱(chēng)取0.2 g不同品種菊花花瓣，添加10 mL花青素苷浸提劑，在室溫下避光浸提24 h后濾去花瓣，濾液用于測(cè)定花青素苷含量。取1 mL樣品稀釋液分別加入pH值為1.0和4.5的緩沖溶液定容至10 mL，室溫下平衡105 min后，以浸提液調(diào)零，于515 nm和700 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。根據(jù)Giusti等的研究，按公式(1)計(jì)算舌狀花花瓣中花青素苷含量[18]。

X1=(ΔT×V×F×M×1000)/(ε×m)

公式(1)

式中X1：花青素苷含量(mg/g)；ΔT:吸光度值，ΔT=(A515nm-A700nm)pH1.0-(A515nm-A700nm)pH4.5；V:浸提液體積(L)；F:稀釋倍數(shù)；M:矢車(chē)菊-3-O-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量449.2；ε:摩爾消光系數(shù)26 900；m:樣品質(zhì)量(g)。

1.3.3 單花序花青素苷含量的計(jì)算 單花序花青素苷的含量由單花序花瓣干質(zhì)量與花青素苷含量相乘求得(mg)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)運(yùn)算并作圖；采用SPSS 11.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并判斷不同菊花品種間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 7個(gè)菊花品種不同采收期產(chǎn)量及品質(zhì)的變化

2.1.1 7個(gè)菊花品種不同采收期單花序花瓣干質(zhì)量的變化 由表1可知，隨開(kāi)花進(jìn)程的推進(jìn)，7個(gè)菊花品種單花序花瓣干質(zhì)量逐漸增加，粉色思緒和粉小菊干質(zhì)量持續(xù)增加直到Ⅶ期達(dá)到最大值，橙小菊、紫玉和姹紫嫣紅干質(zhì)量在Ⅴ期達(dá)到最大值后逐漸下降，意大利紅和紅五九干質(zhì)量在Ⅵ期達(dá)到最大值后下降。小菊品種中，紅五九單花序花瓣干質(zhì)量在Ⅳ期、Ⅴ期和Ⅵ期較高，與粉色思緒相比其最大值略低。大菊品種由于舌狀花數(shù)量多，體積大，單花序花瓣干質(zhì)量及其最大值均明顯高于小花品種，以紫玉較大。表明，小菊品種紅五九選擇在Ⅵ期采收，粉色思緒選擇在Ⅶ期采收，大菊品種紫玉選擇在Ⅴ期采收，可以獲得較高的單花序花瓣干質(zhì)量。

表1 7個(gè)菊花品種不同采收期單花序花瓣干質(zhì)量的變化 mg/g

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)和大寫(xiě)字母分別表示0.05和0.01水平上的差異顯著，下同。

2.1.2 7個(gè)菊花品種花青素苷含量的變化 由表2可知，隨開(kāi)花進(jìn)程的推進(jìn)，7個(gè)菊花品種花青素苷含量均呈先增加再減少的趨勢(shì)，粉色思緒和粉小菊最大值出現(xiàn)在Ⅲ期，橙小菊、紅五九、紫玉和姹紫嫣紅最大值出現(xiàn)在Ⅳ期，意大利紅最大值則出現(xiàn)在Ⅴ期。紅五九和意大利紅花青素苷含量明顯高于其他5個(gè)品種，在Ⅳ期和Ⅴ期均以紅五九較高，其最大值在所有小花品種不同采收期中最高。表明，紅五九選擇在Ⅳ期采收，可以獲得較高花青素苷含量。

2.1.3 7個(gè)菊花品種單花序花青素苷含量的變化 由表3可知，隨開(kāi)花進(jìn)程的推進(jìn)，粉小菊單花序花青素苷含量總體上持續(xù)增加；粉色思緒在Ⅲ期達(dá)到最大值后略有下降，Ⅴ期后又逐漸恢復(fù)，在Ⅶ期再次達(dá)到最大值；其他5個(gè)品種均呈先增加后減少的趨勢(shì)，其中橙小菊和紅五九在Ⅳ期達(dá)到最大值，意大利紅、紫玉和姹紫嫣紅則在Ⅴ期達(dá)到最大值。大菊品種單花序花青素苷含量均明顯高于小花品種，其中紫玉較高，其最大值在7個(gè)品種中最高；小菊品種中以紅五九最高，其次是意大利紅，其他3個(gè)小菊品種均較低。表明，小菊品種紅五九選擇在Ⅳ期采收，大菊品種紫玉選擇在Ⅴ期采收，可以獲得較高的單花序花青素苷含量。

表2 7個(gè)菊花品種不同采收期花青素苷含量的變化 mg/g

表3 7個(gè)菊花品種不同采收期單花序花青素苷含量的變化 mg/g

綜合2.1結(jié)果，在小菊品種中，紅五九單花序花瓣干質(zhì)量在Ⅳ期之后均較高，在Ⅳ期出現(xiàn)花青素苷含量和單花序花青素苷含量最大值，并且高于其他4個(gè)小花品種，即紅五九在5個(gè)小花品種中產(chǎn)量最高，品質(zhì)最優(yōu)；與2個(gè)大花品種相比，紅五九的單花序花瓣干質(zhì)量和單花序花青素苷含量較低，但其花青素苷含量較高，品質(zhì)更優(yōu)，因此，可選擇小菊品種紅五九為花青素苷提取專(zhuān)用菊種質(zhì)，其適宜采收期可初步確定為Ⅳ期。

2.2 小菊品種紅五九不同采收期不同批次產(chǎn)量及品質(zhì)的變化

2.2.1 紅五九不同采收期不同批次單花序花瓣干質(zhì)量的變化 由表4可知，按采收期分析批次間變化，隨著采收批次的推遲，紅五九單花序花瓣干質(zhì)量基本呈逐漸下降的變化趨勢(shì)，其中在Ⅱ期和Ⅲ期采收時(shí)，前4個(gè)批次間變化幅度較大，在Ⅳ期和Ⅴ期采收時(shí)則較平穩(wěn)。按批次分析采收期間變化，隨著采收期的推遲，單花序花瓣干質(zhì)量逐漸增加，在Ⅳ期和Ⅴ期采收時(shí)達(dá)到最大，這2個(gè)采收期之間差異多數(shù)情況不顯著(第3批次，在Ⅳ期采收略低于在Ⅴ期采收除外)。表明，在Ⅳ期和Ⅴ期采收，尤其是在前4個(gè)批次采收，有利于獲得較高的紅五九單花序花瓣干質(zhì)量。

2.2.2 紅五九不同采收期不同批次花青素苷含量的變化 由表4可知，按采收期分析批次間變化，隨著采收批次的推遲，紅五九花青素苷含量呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)，具體為：在Ⅱ期采收時(shí)逐漸增加；在Ⅲ期采收時(shí)變化基本平穩(wěn)(第2批次比第1批次有小幅增加，第3、4批次與第1批次相近，第5批次比第1批次有小幅減少)；在Ⅳ期采收時(shí)變化平穩(wěn)(11.91～12.99 mg/g)；在Ⅳ期采收時(shí)變化平穩(wěn)；在Ⅴ期采收時(shí)逐漸下降。按批次分析采收期間變化，在第1批次采收時(shí)，隨著采收期的推遲，花青素苷含量逐漸增加，處理間差異均達(dá)到顯著或極顯著水平；在第2批次采收時(shí)，在Ⅴ期采收的花青素苷含量較高；在第3批次采收時(shí)，不同采收期之間差異均不顯著；在第4和第5批次采收時(shí)，則Ⅱ期最高、Ⅳ期居中、Ⅲ期和Ⅴ期最低(第4批次時(shí)，Ⅳ期和Ⅲ期之間差異不顯著)。表明，Ⅴ期采收的第1和第2批次，Ⅱ期采收的第4和第5批次紅五九均可以獲得最高的花青素苷含量；在Ⅳ期采收紅五九，不同批次樣品花青素苷含量均比較高且變化穩(wěn)定。

2.2.3 紅五九不同采收期不同批次單花序花青素苷含量的變化 由表4可知，紅五九不同采收期5個(gè)采收批次的單花序花青素苷含量與單花序花瓣干質(zhì)量變化趨勢(shì)和處理間差異基本一致。不同之處在于，按采收期分析批次間變化，Ⅱ期采收時(shí)，不同批次樣品間變化基本平穩(wěn)，有一定幅度波動(dòng)；Ⅴ期采收時(shí)隨采收批次推遲，單花序花青素苷含量持續(xù)下降。按批次分析采收期間變化，在第1和第2批次，Ⅳ期低于Ⅴ期，在第3批次，二者持平；在第4批次，Ⅳ期則高于Ⅴ期；在第5次批次采收時(shí)，Ⅱ期高于Ⅲ期，達(dá)到與Ⅳ期和Ⅴ期相同的水平。表明，Ⅴ期和Ⅳ期采收的前4個(gè)批次樣品均可以獲得較高的紅五九單花序花青素苷含量，以Ⅳ期采收變化較平穩(wěn)。

表4 小菊品種紅五九不同采收期不同批次產(chǎn)量及品質(zhì)的變化

3 結(jié)論與討論

選擇合適的種質(zhì)，確定科學(xué)合理的采收期對(duì)于保證花青素苷提取用菊質(zhì)量，提高其產(chǎn)量具有重要的意義。孫衛(wèi)等[9]研究指出，粉色、紅色和紫色菊花花瓣中花青素苷含量依次增加；Xiang等[19]研究指出，橙色菊花花青素苷含量低于紅色菊花。隨著植物發(fā)育進(jìn)程的推進(jìn)，其有效成分和產(chǎn)量有關(guān)指標(biāo)均發(fā)生變化，這是確定最佳采收期的基本依據(jù)。劉晶等[20]在對(duì)金銀花采收期的研究中指出，花蕾的早期階段是金銀花的最佳采收時(shí)期；楊俊等[21]和胡碧波等[22]的研究指出，杭白菊中的總黃酮和木犀草素-7-β-D-葡萄糖苷在開(kāi)花初期均較高，也與杭白菊在生產(chǎn)實(shí)際中多在蕾期和開(kāi)花初期采收相一致。

本研究7個(gè)菊花品種不同采收期試驗(yàn)結(jié)果顯示，小菊品種按花青素苷含量最大值從小到大的順序依次為：粉色思緒(粉色)< 橙小菊(橙色)<粉小菊(粉色)<意大利紅(紅色)<紅五九(紫色)，與已有研究結(jié)果基本一致。2個(gè)紫色大菊品種的花青素苷含量峰值較低，與橙小菊相近，介于粉小菊和粉色思緒之間，這可能與其舌狀花花瓣面積大，表現(xiàn)在舌狀花花瓣干質(zhì)量大，對(duì)花青素苷起到了稀釋效應(yīng)有關(guān)，這2個(gè)品種在Ⅴ期達(dá)到最大值時(shí)差異不顯著。在花青素苷含量上，小菊品種紅五九最高，盡管其單花序花青素苷含量低于大菊品種紫玉和姹紫嫣紅，但是其單株平均頭狀花序數(shù)可達(dá)460余朵，單株總花青素苷產(chǎn)量遠(yuǎn)高于同等土地面積上的大菊品種的花青素苷產(chǎn)量，因此初步確定紅五九為花青素苷提取專(zhuān)用菊種質(zhì)。由于本試驗(yàn)條件所限，僅涉及7個(gè)具有代表意義的菊花種質(zhì)，小菊品種紅五九在豐富的菊花種質(zhì)資源庫(kù)中可能并不是最理想的花青素苷提取專(zhuān)用菊種質(zhì)，但本研究為繼續(xù)開(kāi)展相關(guān)探索，篩選出更優(yōu)秀的花青素苷提取專(zhuān)用菊種質(zhì)提供了參考。由于紅五九在Ⅳ期采收時(shí)，單花序花瓣干質(zhì)量、花青素苷含量和單花序花青素苷含量均較高，因此，初步確定其適宜采收期為Ⅳ期。

上述結(jié)果是在同一植株上按開(kāi)花進(jìn)程逐漸取材獲得的，能否確實(shí)保障原材料生產(chǎn)的高產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)，答案仍不清楚，為此，本試驗(yàn)進(jìn)一步選擇紅五九不同植株，分別在Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期4個(gè)采收期，分5個(gè)批次采收試驗(yàn)。結(jié)果顯示，Ⅳ期和Ⅴ期單花序花瓣干質(zhì)量均較高，采收批次越晚，單花序花瓣干質(zhì)量越少；Ⅴ期采收的第1、2批次，Ⅱ期采收的第4、5批次花青素苷含量最高，但均存在大幅度的變化，Ⅳ期采收時(shí)，花青素苷含量較高且變化穩(wěn)定；Ⅴ期和Ⅳ期采收的前4個(gè)批次樣品均可以獲得較高的紅五九單花序花青素苷含量，其中Ⅴ期采收的前2個(gè)批次較高，這兩個(gè)采收期的第3批次差異不顯著，Ⅳ期采收的第4批次較高，所有采收期下的第5批次樣品均較低，其中Ⅲ期最低。從獲得品質(zhì)高且在批次間穩(wěn)定、產(chǎn)量也高的原材料角度考慮，選擇在Ⅳ期采收最為理想，這有效驗(yàn)證了上述7個(gè)菊花品種不同采收期試驗(yàn)的結(jié)果。同時(shí)，本試驗(yàn)結(jié)果也提示另一種復(fù)合采收期采收機(jī)制可能具有潛在的優(yōu)勢(shì)，可設(shè)置4個(gè)采收批次，不同批次采收期不同，具體為：第1批次，Ⅴ期(對(duì)應(yīng)分批采收試驗(yàn)Ⅴ期第1批次)；第2批次，Ⅴ期(對(duì)應(yīng)分批采收試驗(yàn)Ⅴ期第2批次)、Ⅳ期(對(duì)應(yīng)分批采收試驗(yàn)Ⅳ期第3批次)和Ⅱ期(對(duì)應(yīng)分批采收試驗(yàn)Ⅱ期第5批次)；第3批次，Ⅳ期(對(duì)應(yīng)分批采收試驗(yàn)Ⅳ期第4批次)；第4批次，Ⅳ期(對(duì)應(yīng)分批采收試驗(yàn)Ⅳ期第5批次)。采用復(fù)合采收期采收機(jī)制可能有利于進(jìn)一步提高小菊品種紅五九的產(chǎn)量和品質(zhì)，減少采收次數(shù)，對(duì)此尚需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在Ⅴ期采收的前2個(gè)批次紅五九產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)，在Ⅱ期采收的第5批次可以獲得最高的舌狀花花瓣花青素苷含量，單花序舌狀花花瓣花青素苷含量與Ⅳ期和Ⅴ期采收差異不顯著，如果按7個(gè)采收期設(shè)置分批次采收試驗(yàn)，是否會(huì)有新的發(fā)現(xiàn)，對(duì)此尚待進(jìn)一步研究。