魏小春，原玉香，趙艷艷，王志勇，楊雙娟，鄭小蘭，段俊枝，張曉偉*

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所,河南 鄭州 450002； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟與信息研究所，河南 鄭州 450002)

細胞色素C氧化酶(Cytochrome C oxidase，COX)也稱細胞色素氧化酶，能夠以氧化磷酸化的方式為細胞供能。細胞色素C氧化酶作為線粒體呼吸鏈組成的關(guān)鍵部分，對細胞提供能量至關(guān)重要。它是位于線粒體電子傳遞鏈上的一種氧化酶、膜蛋白酶，并且是呼吸鏈中電子受體的最后一個。細胞色素C氧化酶是線粒體電子傳遞鏈復(fù)合體的多亞基末端氧化酶，在三磷酸腺苷生產(chǎn)調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用[1-2]。其活性受張力、膜脂質(zhì)環(huán)境、激素調(diào)節(jié)以及蛋白質(zhì)修飾的影響[2-4]。細胞色素C氧化酶一般含有4～13個亞基，亞基數(shù)目在不同生物中不等。COX11是核基因編碼的線粒體蛋白，在生物體中的主要功能是在組裝過程中將Cu插入COX復(fù)合物。COX11蛋白家族的幾個成員已被證明在向COX亞基Ⅰ遞送過程中起關(guān)鍵作用[5-6]。COX10和COX11在球形紅菌(Rhodobactersphaeroides)中起到和細胞色素氧化酶亞基Ⅱ、Ⅲ的蛋白質(zhì)分子伴侶功能[7]。研究發(fā)現(xiàn)，COX11具有消除活性氧的功能，是真核生物的一個新的細胞程序性凋亡(PCD)的抑制因子。與野敗型細胞質(zhì)雄性不育基因WA352的互作干擾了COX11的正常功能，導(dǎo)致水稻花藥絨氈層線粒體的活性氧暴發(fā)和細胞色素C釋放到細胞漿(這是PCD的誘導(dǎo)因素)，提前啟動PCD控制的絨氈層降解，從而產(chǎn)生花粉敗育[8]。

大白菜(Brassicarapassp.pekinensis)為蕓薹屬葉用蔬菜(基因組AA，2n=20)。作為重要的蔬菜作物在中國乃至全球種植，年產(chǎn)值在600億元以上。在我國種植面積達270萬hm2以上，占全國蔬菜總種植面積的15%左右[9-11]，然而尚未有關(guān)大白菜COX11基因(BrCOX11)的報道，為此開展大白菜COX11基因克隆和表達分析，旨在為COX11基因功能的鑒定提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料大白菜為河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所選育的Ogura雄性不育系Tyms、Polima雄性不育系22 m2、保持系Y231-330、抗根腫病DH系Y635-10、感根腫病DH系Y177-47。所有材料于2016年在河南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開發(fā)基地種植，統(tǒng)一栽培管理。根腫病材料鑒定參考河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所生物育種實驗室建立的方法進行：在培養(yǎng)間內(nèi)培育材料，培養(yǎng)條件16 h光照/8 h黑暗、光照強度120 μmol/(m2·s)、溫度(22±2)℃。采用灌根接種法鑒定抗性。每個小區(qū)定植27株幼苗，制備根懸浮液，每個材料灌根10～35 d，之后對根部進行逐一分級調(diào)查[12]。

1.2 大白菜總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

RNA提取參照Trizol法，以RNA作為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.3 基因引物設(shè)計與合成

根據(jù)相關(guān)序列設(shè)計引物(表1)，由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司合成。

表1 大白菜基因克隆及其表達檢測所用引物

1.4 BrCOX11基因3′RACE及cDNA全長克隆

轉(zhuǎn)錄組測序Denovo組裝結(jié)果片段，設(shè)計引物進行3′RACE(SMARTer RACE cDNA Amplification Kit,Clontech)，按照獲得的完整編碼區(qū)設(shè)計引物擴增cDNA全長。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃ 變性30 s，54 ℃ 退火3 min，72 ℃延伸1 min，35次循環(huán)。

采用瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物，檢測合格后回收片段，連接Infusion克隆載體(In-Fusion HD Cloning Kit,Clontech)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，檢測得到陽性單克隆，之后測序。DNA MarkerⅢ為DL 5000(Takara,Dalian)。

1.5 序列分析

按照目的基因序列，在NCBI的Blastp工具欄對所編碼的蛋白質(zhì)進行同源序列比對，用Clustal X軟件進行序列比對分析，用MEGA 7.0軟件構(gòu)建進化樹，用ProtParam軟件分析BrCOX11基因編碼的氨基酸理化性質(zhì)，用SOPMA(Secondary structure prediction method)預(yù)測分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，用軟件BaCelLo(Balanced subcellular localization predictor)進行亞細胞定位預(yù)測，用軟件ProtScale分析氨基酸序列的親水性/疏水性。

1.6 基因表達分析

提取大白菜葉片、根部及花蕾總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。定量PCR反應(yīng)體系為20.0 μL[10 μL 2×SYBR?Premix ExTaqTM(Tli RNaseH Plus)，2 μL cDNA，上、下游引物(qCOX11F及qCOX11R)各1 μL(引物濃度10 μmol/L)，6 μL ddH2O]。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，40次循環(huán)。每個樣品重復(fù)3次。內(nèi)參基因為Actin。采用羅氏公司LightCycler?480Ⅱ?qū)崟r熒光定量PCR儀，對目的基因進行實時熒光定量PCR擴增。用2-△△CT法計算基因相對表達量[13]。

大白菜組織特異性及根腫病數(shù)據(jù)來自 SRR643621、SRR643622、SRR643623、SRR643624、SRR643625、SRR643626、SRR643627、SRR643628、SRR3571023、SRR3571024。相對表達量為FPKM[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大白菜BrCOX11基因克隆

根據(jù)3′RACE結(jié)果(圖1A)，組裝成完整編碼區(qū)，設(shè)計引物，進行PCR擴增，凝膠電泳，觀察條帶可以看出目的片段大小為1 300 bp左右(圖1B)，將所需的片段回收，然后連接、轉(zhuǎn)化，進行單克隆測序。該基因與數(shù)據(jù)庫中目的片段相同，具有完整的ORF，為861 bp，編碼286個氨基酸，命名為BrCOX11。

圖1 大白菜BrCOX11基因PCR擴增

2.2 BrCOX11基因編碼氨基酸序列同源性分析

通過比對分析大白菜BrCOX11基因的序列，發(fā)現(xiàn)其編碼蛋白質(zhì)有COX11結(jié)構(gòu)域(圖2)。用Clustal X進行多重比對分析發(fā)現(xiàn)，大白菜與其他作物COX11氨基酸序列高度相似，是COX家族的一員(圖3)。

圖2 大白菜BrCOX11結(jié)構(gòu)域預(yù)測

2.3 BrCOX11蛋白理化性質(zhì)預(yù)測及親水性分析

用ProtParam軟件預(yù)測大白菜BrCOX11氨基酸的理化性質(zhì)，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量32.206 ku，理論等電點8.75，分子式C1 434H2 214N386O435S12，脂肪系數(shù)66.78，疏水性平均值-0.394。含量最高的氨基酸是絲氨酸(相對含量達到10.5%)，色氨酸和半胱氨酸含量較低。疏水性平均值小于零，說明BrCOX11是親水性蛋白。

2.4 BrCOX11蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

用SOPMA軟件分析BrCOX11蛋白的二級結(jié)構(gòu)：α-螺旋(h) 21.68%、延伸鏈(e)20.63%、β-轉(zhuǎn)角(t) 5.24%、無規(guī)則卷曲(c) 52.45%，多肽鏈通過形成二級結(jié)構(gòu)來給BrCOX11蛋白提供穩(wěn)定的空間(圖4)。

圖3 大白菜BrCOX11氨基酸序列比對

圖4 大白菜BrCOX11氨基酸二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.5 BrCOX11蛋白進化樹分析

用Blastp進行同源性檢索，用MEGA 7.0構(gòu)建進化樹?？梢钥闯觯蟀撞薆rCOX11與蕓薹屬、擬南芥屬及蘿卜屬親緣關(guān)系最近；而與棉花屬、胡蘿卜屬和黃瓜屬等親緣關(guān)系較遠(圖5)。

圖5 大白菜及其他物種COX11蛋白進化樹分析

2.6 大白菜BrCOX11基因表達分析

從圖6可以看出，無論抗根腫病材料還是感根腫病材料，BrCOX11基因在根腫菌侵染后的根部組織中表達上調(diào)，而在根腫菌侵染后的葉片組織中下調(diào)。

177-47CK、177-47T、L177-47CK、L177-47T分別為感根腫病DH系Y177-47接菌前地下部分、接菌后地下部分、接菌前葉片部分、接菌后葉片部分；635-10CK、635-10T、L635-10CK、L635-10T分別為抗根腫病DH系Y635-10接菌前地下部分、接菌后地下部分、接菌前葉片部分、接菌后葉片部分圖6 BrCOX11基因在大白菜抗根腫病DH系Y635-10、感根腫病DH系Y177-47中的相對表達量

從圖7可以看出，BrCOX11基因在大白菜不同組織器官如根、莖、葉、果莢中的表達量均不相同，其中，在果莢中表達量最高。

圖7 BrCOX11基因在大白菜不同組織器官中的相對表達量

從圖8中可以看出，BrCOX11在大白菜Ogura雄性不育系Tyms 和Polima雄性不育系22m2中表達量明顯低于其共同保持系Y231-330中的表達量。

圖8 BrCOX11基因在大白菜雄性不育系Tyms 、22m2及保持系Y231-330中的相對表達量

3 結(jié)論與討論

通過對在雜交稻中廣泛利用的野敗型細胞質(zhì)雄性不育(Cytoplasmic male sterility，CMS)基因WA352的克隆，發(fā)現(xiàn)該基因由多個功能未知的線粒體基因片段重組而成。研究發(fā)現(xiàn)，COX11具有消除活性氧的功能，是真核生物保守的一個新的細胞程序性凋亡抑制因子，與WA352蛋白的互作干擾了COX11的正常功能，導(dǎo)致水稻花藥絨氈層線粒體的活性氧暴發(fā)和細胞色素C釋放到細胞漿，提前啟動PCD控制的絨氈層降解，從而產(chǎn)生花粉敗育[8]。為了闡明植物線粒體新基因的起源進化機制，又對800多份野生稻和栽培稻材料的線粒體基因組進行序列分析，發(fā)現(xiàn)11種與WA352相關(guān)的重組結(jié)構(gòu)，3個新的CMS基因WA352a、WA352b、WA314。證明這些CMS新基因是由2個結(jié)構(gòu)相似但沒有CMS功能的原基因通過序列變異和自然選擇，獲得了與COX11的互作能力即功能化演化而來，將有助于進一步了解CMS基因和恢復(fù)基因協(xié)同進化和互作的分子機制[15]。

COX11在花粉發(fā)育乃至植物生長發(fā)育的整個過程起著重要作用。COX11的敲除和過表達都會干擾蛋白質(zhì)的功能，并具有顯著的表型效果。研究表明，敲除擬南芥AtCOX11基因抑制植物的根生長；高水平的COX11可導(dǎo)致其蛋白質(zhì)失去活性[16]。AtCOX11在擬南芥中不僅有供應(yīng)能量的功能，而且通過不相關(guān)的功能，促進花粉萌發(fā)[17]。AtCOX11還參與水稻中COX11同源物的ROS代謝調(diào)控[8]。COX11啟動子主要活躍在具有高分裂和/或高代謝率的組織，例如胚胎吸收過程中的COX11啟動子，在發(fā)芽前需要區(qū)分、并修復(fù)其線粒體所產(chǎn)生的活性氧[18]。所有活躍組織都取決于呼吸鏈復(fù)合物的連續(xù)形成，因此需要足夠量的組裝因子如COX11。在這方面，它類似于與COX功能相關(guān)的其他基因的表達模式，例如COX組裝因子HCC1(用于同源物銅伴侶SCO1)[19]，COX亞基COX5b-1[20]和細胞色素C編碼基因CYCT-1和CYCT-2[21]。

BrCOX11基因的表達量在大白菜不同的組織器官中存在明顯差異，可能與組織特異性有一定的關(guān)系[22-23]。BrCOX11基因在抗根腫病和感根腫病材料以及大白菜地上及地下部分的表達量存在不同，說明該基因的表達量和大白菜是否抗根腫病也有一定的關(guān)系。BrCOX11基因的表達量在Ogura雄性不育系Tyms 和Polima雄性不育系22m2、保持系Y231-330中的相對表達量存在不同，在保持系中的相對表達量較高，說明該基因的表達可能與花粉發(fā)育及雄性不育有關(guān)。