張夢雅，孟慶芳，張 林，高 穎，閆紅飛*，劉大群，2*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/國家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心/河北省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程技術(shù)研究中心，河北 保定 071000； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 研究生院, 北京 100081)

由小麥葉銹菌(Pucciniatriticina)引起的小麥葉銹病是小麥生產(chǎn)上的重要病害之一，在世界各麥區(qū)均有發(fā)生且危害嚴(yán)重[1]。由于各麥區(qū)栽培品種、發(fā)病早晚不同，小麥葉銹病造成的產(chǎn)量損失在7%～30%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)50%以上[2]。20世紀(jì)70年代我國曾多次流行小麥葉銹病，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。近年來，隨著小麥葉銹菌群體組成、環(huán)境氣候和小麥品種的變化，該病害的發(fā)生日趨嚴(yán)重。2012年全國范圍小麥葉銹病發(fā)生嚴(yán)重，2013年山東、河南和新疆局部地區(qū)發(fā)生嚴(yán)重，2015年黃淮海地區(qū)發(fā)生大流行，尤其以河南、安徽等省發(fā)生嚴(yán)重。小麥葉銹菌新生理小種的出現(xiàn)、群體組成和結(jié)構(gòu)的變化對小麥葉銹病的發(fā)生流行起重要作用[4]，研究小麥葉銹菌小種和寄主品種的關(guān)聯(lián)性對掌握小麥葉銹菌的群體遺傳結(jié)構(gòu)和流行動(dòng)態(tài)、病害防控及小麥抗病育種具有重要意義。

目前，小麥葉銹菌遺傳多樣性研究主要基于毒性和分子生物學(xué)2個(gè)方面。毒性分析法需要進(jìn)行小種的分離純化、擴(kuò)繁和接菌鑒定等，雖然直觀，但步驟繁瑣、工作量大、耗時(shí)長，且容易受鑒別寄主、環(huán)境條件和人為因素的影響[5]。分子生物學(xué)手段快速、簡便和精準(zhǔn)，且不易受發(fā)育時(shí)期限制和環(huán)境因素影響，已成為分析小麥葉銹菌遺傳多樣性的一種有效方法[6]。簡單重復(fù)序列標(biāo)記(SSR)[7]、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性片段技術(shù)(RAPD)[8]、通用引物PCR技術(shù)(UP-PCR)[9]等均有應(yīng)用報(bào)道。趙盼盼等[10]曾利用21對EST-SSR(基于表達(dá)序列標(biāo)簽開發(fā)微衛(wèi)星的一種新型分子標(biāo)記)引物對不同地區(qū)、不同年份的小麥葉銹菌菌株進(jìn)行了分子多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)葉銹菌群體間的親緣關(guān)系與地理分布具有一定的相關(guān)性，用分子手段證明小麥葉銹菌遺傳多樣性較高，但不同群體間多樣性水平有差異。這些分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用為小麥葉銹菌遺傳多樣性的研究提供了快速、簡便的方法。

2015年小麥葉銹病在黃淮海地區(qū)大流行[11]，河南省大部分地區(qū)發(fā)病更是嚴(yán)重。為了揭示不同小麥品種普遍發(fā)病的原因，以河南周口小麥試驗(yàn)田的品種為研究對象，采用分子快速檢測方法對區(qū)試田小麥葉銹菌的群體組成及遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，為小麥葉銹病防控、小麥品種合理布局提供指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 小麥葉銹菌樣品采集

供試小麥葉銹菌樣品采集于周口市南、西的2塊周口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥品種區(qū)試苗圃，2015年隨機(jī)采取不同品種葉片上的葉銹菌，以樣本癥狀典型、發(fā)病充分、菌量大為標(biāo)準(zhǔn)，直接將小麥葉片上葉銹菌夏孢子堆收集于1.5 mL離心管中，每管約50 mg，干燥后儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中備用。共采集63份樣品，詳見表1。

表1 小麥葉銹菌菌株編號及來源

續(xù)表1 小麥葉銹菌菌株編號及來源

注：菌株1—27來源于周口南地塊，28—63來源于周口西地塊。

1.2 EST-SSR擴(kuò)增及電泳檢測

參照康健等[12]的Chelex-100法對63份供試菌株提取DNA。試驗(yàn)采用Wang等[13]報(bào)道的17對EST-SSR引物。PCR反應(yīng)體系10 μL：模板DNA(30 ng/μL) 1.0 μL，TaqDNA聚合酶(2.5 U/μL)0.1 μL，10×PCR Buffer 1.0 μL，dNTPs(10 mmol/L) 0.2 μL，上、下游引物(5 mmol/L)各0.2 μL，無菌超純水7.3 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54～61 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

1.3 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物清晰可重復(fù)的條帶，構(gòu)建0、1矩陣(有帶為1，無帶為0)。利用NTSYS 2.1軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行UPGMA聚類分析，利用POPGENE軟件進(jìn)行群體遺傳多樣性分析，利用Arlequin 3.11軟件對小麥葉銹菌的分子變異進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥葉銹菌EST-SSR分析

檢測結(jié)果表明，17對EST-SSR引物中僅Ptssr5649、Ptssr2948未擴(kuò)增出多態(tài)性條帶，表明該引物對葉銹菌小種不具有區(qū)分能力；而其余15對引物可在63個(gè)供試葉銹菌株基因組中擴(kuò)增出穩(wěn)定清晰的多態(tài)性條帶，用以區(qū)分不同的葉銹菌小種。63份小麥葉銹菌材料擴(kuò)增出62種帶型，代表62種分子小種，14號小麥品種俊達(dá)109與35號小麥品種糧源A8上收集的葉銹菌材料擴(kuò)增帶型完全一致，表明其為同種小麥葉銹菌的分子小種。

2.2 小麥葉銹菌聚類分析

利用NTSYS 2.1軟件對63個(gè)供試小麥葉銹菌株的EST-SSR引物擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行聚類分析，其相似系數(shù)為0.70～1.00，表明在小麥葉銹菌群體內(nèi)存在一定的遺傳多樣性，結(jié)果見圖1。在相似系數(shù)0.716處將63個(gè)菌株聚為V1、V2和V33組。V1組共包括6個(gè)菌株，其寄主品種為鄭麥369、豫農(nóng)306、安農(nóng)1206、泉麥890、渦麥1212、秋樂2128，除豫農(nóng)306和泉麥890外，其他4個(gè)品種親本來源相同，均為輝縣紅。V3組包括7個(gè)菌株，其寄主品種為皖科981、安科1403、綠雨1408、瑞星麥618、鄭品麥22、中育1152、新麥33，其中除皖科981和鄭品麥22外，其他5個(gè)品種的親本來源相同，均為豫麥2號。V2組的50個(gè)菌株在相似系數(shù)0.737處分為V2-1和V2-22個(gè)亞組。其中，V2-1共5個(gè)菌株，其寄主品種為偃高21、中金13、洛麥26、豫糧1688、商麥167，親本來源均為豫麥2號。V2-2的45個(gè)菌株在相似系數(shù)0.775處分為V2-2-1和V2-2-22個(gè)組，其中品種阜麥18上的葉銹菌株獨(dú)立形成V2-2-2組，與V2-2-1組的菌株遺傳相似性較低，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。V2-2-1組包含44個(gè)菌株，寄主品種徐麥0054、樂麥Z1311273和龍科1109上的葉銹菌株聚在同一分支，其親本來源相同，均來自豫麥2號；俊達(dá)109、糧源A8、鄭麥113、金麥201、機(jī)麥211、耕豐麥1號、矮豐339上的7個(gè)菌株聚在同一分支，其寄主親本也均來自豫麥2號。俊達(dá)109和鄭育麥16兩個(gè)品種系譜來源完全相同，均來自豫麥2號/鄭91138//濟(jì)麥4號，但2個(gè)菌株間的遺傳相似性低于俊達(dá)109和糧源A8之間的遺傳相似性。以上分析表明，葉銹菌遺傳多樣性與寄主品種的系譜來源有很大關(guān)系，一般情況下寄主品種的系譜來源越相似，其上的葉銹菌遺傳相似性越高，親緣關(guān)系越近。

1—63代表小麥葉銹菌株

2.3 小麥葉銹菌小種和寄主品種的相關(guān)性分析

在遺傳相似系數(shù)0.96處，11號菌株(寄主品種徐麥0054)比40號菌株(寄主品種樂麥Z1311273)多一條238 bp條帶，少一條242 bp條帶，其寄主親本中均含有豫麥2號。在遺傳相似系數(shù)0.98處，23號菌株(寄主品種鄭麥113)比29號菌株(寄主品種金麥201)僅多一條238 bp的條帶，其寄主親本的來源為鄭91138和豫麥2號。在相似系數(shù)1.00處，14號菌株(寄主品種俊達(dá)109)與35號菌株(寄主品種糧源A8)帶型完全一致，其寄主親本的來源均為豫麥2號。由此可見，品系來源越相似，該品種上的小麥葉銹菌分子小種越相似，遺傳多樣性越小。據(jù)此推測每個(gè)品種上的小麥葉銹菌可能由多種不同的葉銹菌株混合而成，聚在一個(gè)組里表明這些品種上的小麥葉銹菌菌株相同或相似。

2.4 小麥葉銹菌群體遺傳多樣性分析

利用POPGENE軟件對河南周口2塊苗圃葉銹菌株進(jìn)行群體遺傳多樣性參數(shù)分析。在物種水平和群體水平上，Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)均為0.22，多態(tài)位點(diǎn)百分率(P)分別為78.72%和73.41%，表明2塊苗圃供試小麥葉銹菌遺傳多樣性豐富。周口南和周口西地塊葉銹菌群體的Nei’s基因多樣性指數(shù)分別為0.21和022，Shannon信息指數(shù)(I)分別為0.32和0.34，多態(tài)位點(diǎn)百分率分別為72.34%和74.47%，表明周口西地塊葉銹菌群體比周口南的遺傳多樣性稍高(表2)。

表2 小麥葉銹菌基于EST-SSR的群體遺傳多樣性參數(shù)

2.5 小麥葉銹菌群體的遺傳變異分析

利用POPGENE軟件對周口2個(gè)地塊的所有供試葉銹菌群體進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示，供試葉銹菌株總遺傳多樣性(Ht)為0.22，群體內(nèi)遺傳多樣性(Hs)為0.21，群體間遺傳多樣性(Dst)為0.01，遺傳分化系數(shù)(Gst)為0.05，群體內(nèi)遺傳多樣性占總遺傳多樣性的95.45%，而群體間遺傳多樣性僅占4.55%，說明葉銹菌群體內(nèi)遺傳多樣性顯著高于群體間。Nei’s遺傳相似系數(shù)為0.978 7，遺傳距離為0.021 5，表明2個(gè)地塊間不同寄主小麥品種的葉銹菌群體分子結(jié)構(gòu)類似。利用Arlequin 3.11軟件的AMOVA程序?qū)?個(gè)群體的分子變異分析表明，2個(gè)地塊的小麥葉銹菌遺傳變異發(fā)生在群體間和群體內(nèi)，其中群體內(nèi)遺傳變異占總遺傳變異的94.44%，而群體間遺傳變異僅占總變異的5.56%，這表明小麥葉銹菌的遺傳變異主要發(fā)生在群體內(nèi)部(表3)。

表3 小麥葉銹菌群體間和群體內(nèi)分子變異的AMOVA分析結(jié)果

3 結(jié)論與討論

小麥葉銹菌遺傳多樣性研究有毒性鑒定和分子標(biāo)記2種方法，前者主要依據(jù)病原菌對小麥苗期的致病能力劃分生理小種，操作繁瑣，費(fèi)工費(fèi)時(shí)，準(zhǔn)確性易受環(huán)境條件影響；后者是從基因產(chǎn)生的變異反映病原菌個(gè)體的差異，從本質(zhì)揭示群體遺傳結(jié)構(gòu)等特性，操作簡便且準(zhǔn)確性高。2007年，Ordoez等[14]對北美硬粒小麥和普通小麥上葉銹菌群體的SSR分子遺傳多態(tài)性進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，北美硬粒小麥品系來源相似且單一，其葉銹菌遺傳多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于親本來源不同的普通小麥遺傳多樣性，因此，不同親本來源小麥品種可對小麥葉銹菌的遺傳多樣性造成一定的影響。劉二明[15]在研究稻瘟病菌遺傳多樣性時(shí)發(fā)現(xiàn)，在某一水稻種植區(qū)內(nèi)，水稻栽培品種越多，其上分離出的稻瘟病菌株越多，分屬的譜系和單元型越多，則該稻區(qū)的稻瘟病菌群體遺傳多樣性也更豐富，即稻瘟病菌群體的遺傳多樣性與水稻栽培品種的多樣性呈較明顯的正相關(guān)。在本研究中，聚類分析圖顯示小麥葉銹菌遺傳多樣性與寄主品種有一定關(guān)系，例如V2-1組包括偃高21、中金13、洛麥26、豫糧1688、商麥167上的菌株，而這5個(gè)菌株寄主的親本來源均包含豫麥2號，表明品種系譜來源越相似，其上葉銹菌的遺傳相似性越高，親緣關(guān)系越近，遺傳多樣性越低。在遺傳相似系數(shù)0.844處，可將63個(gè)小麥葉銹菌株分為20個(gè)組(S1—S20)，其中周口南地塊的27個(gè)菌株分屬于13個(gè)組，而周口西地塊的36個(gè)菌株分屬于15個(gè)組。利用POPGENE軟件對兩苗圃葉銹菌進(jìn)行群體遺傳多樣性分析表明，周口西地塊小麥葉銹菌群體遺傳多樣性水平稍高于周口南，由此可見，小麥葉銹菌遺傳多樣性與地理來源并無明顯關(guān)系。

本研究通過EST-SSR分析表明，群體內(nèi)變異為小麥葉銹菌的主要變異來源，與群體間遺傳多樣性相比，群體內(nèi)遺傳多樣性明顯較高，這與Dadrezaie等[16]、Wang等[17]、許敏青等[6]、趙盼盼等[10]的研究結(jié)果一致，同樣證明葉銹菌存在豐富的遺傳多樣性。小麥寄主品種親本來源越相似，其上的葉銹菌小種類型越一致，親緣關(guān)系越近，遺傳多樣性越低。本研究揭示了寄主小麥品種及其親本來源與小麥葉銹菌遺傳多樣性的關(guān)系，為小麥的育種及抗病研究奠定理論基礎(chǔ)，對小麥生產(chǎn)實(shí)踐具有現(xiàn)實(shí)的指導(dǎo)意義。