郜文輝 曾普華 黃惠勇 葉書(shū)林 潘敏求 周芳 李為 劉丹

摘要：目的 觀察益氣化瘀解毒方對(duì)人肝癌細(xì)胞MHCC97-H遷移能力及趨化因子CXCL12、CXCR4、CXCR7表達(dá)的影響，探討其相關(guān)作用機(jī)制。方法 以索拉非尼為陽(yáng)性對(duì)照，CCK-8法測(cè)定益氣化瘀解毒方及索拉非尼對(duì)MHCC97-H細(xì)胞增殖的作用及最佳作用濃度，劃痕實(shí)驗(yàn)觀察MHCC97-H細(xì)胞遷移能力；Western blot檢測(cè)藥物干預(yù)24 h后CXCL12、CXCR4、CXCR7的蛋白表達(dá)。結(jié)果 益氣化瘀解毒方及索拉非尼均能抑制MHCC97-H細(xì)胞生長(zhǎng)，24 h半數(shù)抑制濃度分別為0.095 g/mL、10 μmol/mL；益氣化瘀解毒方及索拉非尼均有抑制MHCC97-H遷移的能力；經(jīng)益氣化瘀解毒方干預(yù)后，MHCC9-H細(xì)胞CXCL12、CXCR4、CXCR7蛋白表達(dá)量均下降。結(jié)論 益氣化瘀解毒方能抑制MHCC97-H細(xì)胞增殖及遷移，其機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)CXCL12/CXCR4/CXCR7趨化因子軸發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞：益氣化瘀解毒方；索拉非尼；人肝癌細(xì)胞MHCC97-H；趨化因子

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.07.010

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）07-0041-03

Abstract： Objective To study the effects of Yiqi Huayu Jiedu Prescription on the migration ability of MHCC97-H and the expressions of CXCL12， CXCR4 and CXCR7； To discuss its relevant mechanism of action. Methods Setting Sorafenib as a positive control， CCK-8 method was used for determining the effects of Yiqi Huayu Jiedu Prescription on the cell proliferation of MHCC97-H and the optimum concentration. Scratch assay was used to observe the migration ability of MHCC97-H. The protein expressions of CXCL12， CXCR4 and CXCR7 were detected by Western blot after 24 h of medicine intervention. Results Yiqi Huayu Jiedu Prescription and Sorafenib can inhibit the cell proliferation of MHCC97-H ， and the inhibitory concentration was 0.095 g/mL and 10 μmol/mL at 24 hours. Yiqi Huayu Jiedu Prescription can inhibit migration ability of MHCC97-H. The protein expressions of CXCL12， CXCR4 and CXCR7 in hepatocellular carcinoma cells decreased after the action of Yiqi Huayu Jiedu Prescription. Conclusion Yiqi Huayu Jiedu Prescription can inhibit MHCC97-H cell proliferation and migration， which may be realized by down-regulating chemokine axis of CXCL12/CXCR4/CXCR7.

Keywords： Yiqi Huayu Jiedu Prescription； Sorafenib； MHCC97-H； chemokines

原發(fā)性肝癌（以下簡(jiǎn)稱“肝癌”）具有起病隱匿、高度惡性、進(jìn)展快、預(yù)后差和死亡率高等特點(diǎn)。目前臨床上肝癌存在大多伴有肝病背景、治療缺乏針對(duì)性、難治性耐藥和源頭創(chuàng)新藥物少等問(wèn)題。中藥復(fù)方配伍具有多活性成分、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的抗腫瘤特點(diǎn)，因此，從中醫(yī)藥尋求多靶點(diǎn)抗肝癌新藥可望帶來(lái)新的突破。本課題組前期研究顯示，益氣化瘀解毒方可調(diào)節(jié)免疫、穩(wěn)定瘤體、抗侵襲轉(zhuǎn)移，對(duì)肝癌低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）信號(hào)通路、腫瘤血管微環(huán)境等均有調(diào)節(jié)作用[1-6]。在前期研究的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)觀察益氣化瘀解毒方對(duì)人肝癌細(xì)胞MHCC97-H細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移及趨化因子CXCL12、CXCR4、CXCR7表達(dá)的影響，探討其相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物及制備

益氣化瘀解毒方（白參、黃芪、莪術(shù)、重樓、壁虎等），飲片購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，用10倍溫水浸泡30 min，先煎2 h，藥渣再加8倍水煎煮2次，每次30 min。將3次煎液混勻，濃縮至200 mL，配制成益氣化瘀解毒方母液，濃度為0.5 g/mL。濾紙粗濾，再用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，分裝，-20 ℃保存。使用前稀釋為0.015 6、0.031 2、0.062 5、0.125 g/mL。索拉非尼片，德國(guó)拜耳醫(yī)藥保健公司，批號(hào)700632，規(guī)格200 mg/片。研磨器碾成粉末，稱取50 mg，溶于0.5 mL DMSO、9.5 mL PBS中，配制成索拉非尼母液（5 mg/mL），0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾分裝，-20 ℃保存，DMSO終濃度<0.1%。

1.2 細(xì)胞株

MHCC97-H細(xì)胞，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.3 CCK-8法檢測(cè)MHCC97-H細(xì)胞增殖

取生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)期MHCC97-H細(xì)胞，0.25%胰酶消化，重懸，按細(xì)胞數(shù)為5×103，以100 μL/孔接種于96孔板培養(yǎng)。設(shè)實(shí)驗(yàn)組（100 μL不同濃度的益氣化瘀解毒方、索拉非尼）、對(duì)照組（100 μL細(xì)胞懸液）、空白組（100 μL培養(yǎng)液）。培養(yǎng)24 h后實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的益氣化瘀解毒方（終濃度分別為0.015 6、0.031 2、0.062 5、0.125 g/mL）、索拉非尼（終濃度分別為3.125、6.25、12.5、25、50 μmol/mL），每次處理5個(gè)復(fù)孔。孵育24 h后，每孔加入10 μL CCK8培養(yǎng)1～4 h，于波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定吸光度（A），去除最高值和最低值后取其平均值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率[1-（A實(shí)驗(yàn)組-A空白組）÷（A對(duì)照組-A空白組）]×100%，Graph PadPrism6.0繪制增殖抑制曲線，計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.4 劃痕實(shí)驗(yàn)觀察MHCC97-H細(xì)胞遷移能力

分實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行干預(yù)。根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定益氣化瘀解毒方、索拉非尼干預(yù)濃度分別為0.095 g/mL、10 μmol/mL，對(duì)照組為正常培養(yǎng)的MHCC97-H細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MHCC97-H細(xì)胞懸液，以3×105個(gè)/孔接種于6孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁長(zhǎng)滿90%時(shí)，用10 μL移液槍頭垂直均勻地在6孔板中間劃“+”字。PBS沖洗2遍，加入含不同藥物的含藥培養(yǎng)基和無(wú)藥物培養(yǎng)基，培養(yǎng)基均不含血清，排除細(xì)胞增殖影響。置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，分別于0、24、36 h倒置光學(xué)顯微鏡下拍照，取“+”字上下左右4個(gè)點(diǎn)。細(xì)胞遷移距離（μm）=0 h平均距離-觀察時(shí)平均距離，劃痕平均距離用Image ProPlus計(jì)算。

1.5 Western blot檢測(cè)趨化因子CXCL12、CXCR4、CXCR7的蛋白表達(dá)

設(shè)實(shí)驗(yàn)組益氣化瘀解毒方、索拉非尼藥物濃度分別為0.095 g/mL、10 μmol/mL，對(duì)照組為不加藥物常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞，干預(yù)24 h。Western blot檢測(cè)趨化因子CXCL12、CXCR4、CXCR7的蛋白表達(dá)。提取細(xì)胞，加入蛋白裂解液制備總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度?？偟鞍子?00 ℃加熱變性10 min，取50 μg樣品上樣檢測(cè)。按說(shuō)明書(shū)配制SDS-PAGE膠電泳分離蛋白后，半干式電轉(zhuǎn)膜儀17V，30 min將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST漂洗3×10 min，相關(guān)抗體于4 ℃過(guò)夜，TBST漂洗3×10 min，加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶5000）室溫孵育1 h。TBST漂洗3×10 min后，用電化學(xué)發(fā)光法顯影、定影。利用Tanon凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并進(jìn)行吸光度檢測(cè)，以目的條帶和內(nèi)存條帶的灰度比值代表該目的蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以—x±s表示，組間比較采用方差分析和q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 益氣化瘀解毒方對(duì)MHCC97-H細(xì)胞增殖的影響

益氣化瘀解毒方濃度分別為0.015 6、0.031 2、0.062 5、0.125 g/mL，其24 h抑制率分別為10.90%、70.69%、93.24%、97.73%，干預(yù)24 h IC50為 0.095 g/mL，見(jiàn)表1。索拉非尼濃度分別為3.125、6.25、12.5、25、50 μmol/mL，其24 h抑制率分別為27.36%、46.39%、70.89%、96.71%和98.21%，干預(yù)24 h IC50為10 μmol/mL，見(jiàn)表2。

2.2 益氣化瘀解毒方對(duì)MHCC97-H細(xì)胞遷移的影響

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)益氣化瘀解毒方、索拉非尼分別處理24、36 h后，細(xì)胞劃痕較對(duì)照組明顯變寬。見(jiàn)表3、圖1。

2.3 益氣化瘀解毒方對(duì)趨化因子CXCL12、CXCR4、CXCR7蛋白表達(dá)的影響

經(jīng)藥物干預(yù)后，MHCC9-H細(xì)胞CXCL12、CXCR4、CXCR7蛋白表達(dá)量較對(duì)照組均下降（P<0.01）。見(jiàn)表4、圖2。

3 討論

趨化因子對(duì)原發(fā)性肝癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后起著重要作用。其與受體相互作用能誘導(dǎo)靶細(xì)胞趨化性遷移，增強(qiáng)靶細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附力等，廣泛參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、凋亡等多種生理功能。CXCL12是趨化因子CXC亞家族成員，CXCR4和CXCR7為其同源受體。CXCL12/CXCR4參與多種肝臟疾病的過(guò)程，并與疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。肝星狀細(xì)胞通過(guò)CXCL12/CXCR4趨化因子軸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞侵襲和內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。CXCR4是肝癌增殖和侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中的關(guān)鍵因子之一，與肝癌惡性程度及治療預(yù)后密切相關(guān)。肝細(xì)胞癌（HCC）中存在HIF-1α和CXCR7過(guò)表達(dá)，且CXCR過(guò)表達(dá)與HCC進(jìn)展相關(guān)。CXCR4和CXCR7可激活ERK/MAPK、PI3K/Akt/mTOR、JAK/STAT3等信號(hào)通路，促進(jìn)惡性腫瘤的進(jìn)展。

益氣化瘀解毒方是根據(jù)肝癌“虛、瘀、毒”的基本病機(jī)，經(jīng)病證結(jié)合、精準(zhǔn)配伍而成的臨床效驗(yàn)方。該方以白參、黃芪等益氣健脾，莪術(shù)、石見(jiàn)穿、壁虎、鱉甲等化瘀散結(jié)，重樓、半枝蓮等清熱解毒，全方共奏益氣化瘀解毒之功。

本研究結(jié)果顯示，益氣化瘀解毒方可抑制MHCC97-H細(xì)胞遷移，其作用可能與調(diào)節(jié)CXCL12、CXCR4、CXCR7等趨化因子表達(dá)有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

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（收稿日期：2017-09-02）

（修回日期：2017-10-07；編輯：華強(qiáng)）