齊景翠 祖勉 陳妮姍 郭維維 伊海金 楊仕明 余力生

1北京大學(xué)人民醫(yī)院耳鼻咽喉科100044

2中國人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉研究所，聾病教育部重點實驗室，聾病防治北京市重點實驗室，軍事聲損傷防護實驗室

3清華大學(xué)附屬北京清華長庚醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科

據(jù)WHO統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全世界約有3.6億人患有聽力障礙，在題為“全球疾病負擔(dān)”的名單中，聽力障礙居于第15位(http://www.who.int/topics/global_burden_of_disease)。最近德國一項針對聽力狀況的流行病學(xué)調(diào)查顯示聽力障礙發(fā)病率為16%[1]，我國是聽力障礙人數(shù)最多的國家，耳聾嚴(yán)重影響個人生理心理健康，同時給家庭和社會帶來重大負擔(dān)。

近年來，基因治療為遺傳性疾病的治療帶來新的希望，研究顯示視網(wǎng)膜基因治療以及AAV作為載體在人類是安全有效的[2]。Lalwani等[3]以豚鼠耳蝸為靶器官經(jīng)圓窗注射目的基因開啟了耳科領(lǐng)域的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)研究。隨著研究進展，腺病毒、單純皰疹病毒等病毒載體被用于內(nèi)耳轉(zhuǎn)導(dǎo)，腺相關(guān)病毒作為病毒載體具有其獨特的優(yōu)勢，AAV可以通過特定的受體介導(dǎo)將轉(zhuǎn)基因分子高效地轉(zhuǎn)導(dǎo)入不同的細胞類型。AAVs可以有效地轉(zhuǎn)染毛細胞以及介導(dǎo)入宿主基因組中，從而導(dǎo)致細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)基因蛋白和表型變化的穩(wěn)定、長期表達[4]。其介導(dǎo)的基因治療在遺傳性耳聾小鼠模型中證實聽覺功能的恢復(fù)，具有良好的療效、安全性和長期效果，特別是通過針對毛細胞[5]。小鼠模型是研究耳蝸基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的理想選擇，很多人類耳聾相關(guān)基因突變已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)并且和小鼠的耳聾相關(guān)基因突變相匹配并在小鼠模型得到驗證。本研究通過兩種方式轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠內(nèi)耳攜帶GFP的9型腺相關(guān)病毒，比較兩種方式的可行性、轉(zhuǎn)染效率以及對聽力的影響。為基因治療在內(nèi)耳進一步臨床應(yīng)用打下研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 攜帶無義序列的（pAV-U6-GFP）的重組9型腺相關(guān)病毒（ViGeneBiosciences），滴度3.90E13v.g./ml。

1.1.2 實驗動物及分組健康SPF級4-5周齡C57BL/6J小鼠18只，雌雄不限，18-22g，購自維通利華公司，飼養(yǎng)于解放軍總醫(yī)院動物中心。應(yīng)用CHISS軟件隨機分為兩組，圓窗膜顯微注射組9只，完整圓窗膜途徑組9只，所有動物均采用左側(cè)耳（手術(shù)耳）入路。（該實驗方案通過解放軍總醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)）。

1.1.3 實驗試劑4%PFA,10%EDTA,0.1MPBS緩沖液，鼠源性抗GFP抗體（1:200，天津三箭生物技術(shù)股份有限公司，KM8009），AlexaFluorence-488山羊抗鼠，小鼠解剖器械，Ideal Micro-drill，1ul、2ul微量進樣器（注射器），微量注射泵,組織粘合劑等。

1.2 試驗方法

1.2.1 聽性腦干反應(yīng)閾值檢測

所有動物分別術(shù)前和術(shù)后兩周行左耳ABR測聽，采用美國TDT（型號MCO-18A20）測聽儀器，Biosig32軟件系統(tǒng)測定小鼠ABR閾值，詳見[6]。1%戊巴比妥鈉（0.1ml/10g,腹腔注射）進行麻醉滿意后，置于隔聲屏蔽室內(nèi)，37°C保溫袋保溫，插入電極，直到波形檢測不出，增加5dB SPL，記錄到可重復(fù)的波形，即可標(biāo)記為閾值。

1.2.2 手術(shù)方法

1.2.2.1 術(shù)前準(zhǔn)備高壓滅菌手術(shù)器械，潔凈動物手術(shù)操作臺，術(shù)前30分鐘行紫外線消毒。左側(cè)耳后備皮。

1.2.2.2 麻醉和手術(shù)

實驗動物用1%戊巴比妥鈉（0.1ml/10g,腹腔注射）進行麻醉，置于保溫毯上，麻醉成功后，采用左耳耳后入路方式，頭偏向右側(cè)，碘伏消毒術(shù)區(qū)，鋪無菌巾，解剖顯微鏡下，于左耳后溝中點約2mm處眼科剪切開皮膚，鈍性分離皮下組織暴露耳后肌肉（胸鎖乳突?。7]和面神經(jīng)，鈍性分離牽拉胸鎖乳突肌，可見聽泡后壁，分離表面覆著黏膜組織，于面神經(jīng)出顱處微鉆打孔，直徑0.6-1mm，可見鐙骨動脈和圓窗龕，圓窗膜顯微注射組采用毛細吸管拉制玻璃電極，直徑約10um，輕輕穿刺圓窗膜中心位置，可見淋巴液流出，無菌濾紙吸除液體，待穩(wěn)定后，用直徑約15um的玻璃電極連接微量注射器，置于微量泵上將1ulAAV顯微注射入鼓階（全程約5min）[8]，取脂肪組織封閉聽泡，覆著明膠海綿，逐層縫合切口。完整圓窗膜途徑組用1ul微量注射器將1ulAAV注入圓窗龕內(nèi)[9]，觀察5min，取小塊脂肪組織封閉聽泡，覆著明膠海綿，逐層縫合切口。

1.2.3耳蝸基底膜及冰凍切片制備及觀察

文獻報道[10]AAV在內(nèi)耳的轉(zhuǎn)染效率在轉(zhuǎn)染后2周最高,且與轉(zhuǎn)染后3月對比無顯著差異。為觀察兩種方式AAV轉(zhuǎn)染效率，選擇術(shù)后兩周行ABR測聽后快速斷頭法處死動物，取出耳蝸，顯微鑷蝸尖處打孔，刺破圓窗膜和卵圓窗膜，常溫下4%PFA灌流固定4h后，10%EDTA常溫脫鈣20h。將脫鈣好的耳蝸組織放置0.1M的PBS緩沖液中，在解剖顯微鏡下剝離蝸殼、撕掉蓋膜與前庭膜、切除血管紋及螺旋韌帶，將基底膜從蝸軸上從頂轉(zhuǎn)到底轉(zhuǎn)抬離。將脫鈣好的耳蝸組織脫水，OCT包埋，行冰凍切片。直接在激光共聚焦顯微鏡下觀察（Leica TCS SP8）GFP表達情況。

1.2.4 免疫熒光染色

將制備好的基底膜或者切片組織置于0.25%的TritonX-100室溫孵育30min，0.1M的PBS漂洗3次，每次5min，之后用10%山羊血清室溫封閉30min，加一抗，鼠源性抗GFP抗體（1:200，天津三箭生物技術(shù)股份有限公司，KM8009）4°C孵育過夜，PBS漂洗3次，每次15min，加二抗AlexaFluorence-488山羊抗鼠(1:400,sigma,1605895)。室溫孵育1h，PBS漂洗3次，每次20min，在載玻片上滴加一滴DAPI液，將基底膜放置DAPI液中，蓋玻片封片。

1.2.5 激光共聚焦顯微鏡成像及計數(shù)

Leica TCS SP8選擇488nm波長的激發(fā)光，對基底膜標(biāo)本進行從上到下的掃描觀察。為了統(tǒng)計AAV轉(zhuǎn)染后GFP蛋白表達陽性細胞數(shù)，我們統(tǒng)計跨越200μm區(qū)域的毛細胞和支持細胞的總數(shù)。沿基底膜的整個耳蝸被分成三塊長度相等的基底，中間和頂轉(zhuǎn)[10]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件，數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，各組間術(shù)后兩周和術(shù)前ABR比較采用成組t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)前和術(shù)后兩周ABR閾值測試結(jié)果

術(shù)后兩周圓窗膜顯微注射組、完整圓窗膜途徑組手術(shù)耳與術(shù)前ABR閾值差異均無顯著統(tǒng)計學(xué)差異（表1、表2、圖1）。

圖1 圓窗膜顯微注射組術(shù)前和術(shù)后兩周術(shù)耳ABR、完整圓窗膜途徑組術(shù)前和術(shù)后兩周術(shù)耳ABR比較。Fig.1 Comparison of auditory brainstem response(ABR)threshold across groups,pre-operation of microinjection group(PO-MJ),two weeks post operation of microinjection group(TWPO-MJ),pre-operationofintactRWM group(PO-IR),two weeks post operation of intact RWM group(TWPO-IR).

表1 圓窗膜顯微注射組動物術(shù)后兩周和術(shù)前術(shù)耳ABR閾值（±s，dB SPL）Table 1 ABR threshold of microinjection group at two weeks post operation and pre-operation

表1 圓窗膜顯微注射組動物術(shù)后兩周和術(shù)前術(shù)耳ABR閾值（±s，dB SPL）Table 1 ABR threshold of microinjection group at two weeks post operation and pre-operation

CLICK 4K 8K 12K 24K 38.89±4.17 41.11±8.94 29.44±6.35 20.00±3.54 45.56±8.08 41.11±7.41 41.67±11.99 36.11±8.94 24.44±9.50 47.22±10.95 0.84 0.14 2.07 1.74 0.46 0.43 0.89 0.07 0.12 0.66

表2 完整圓窗膜途徑組動物術(shù)后兩周和術(shù)前術(shù)耳ABR閾值（±s，dB SPL）Table 2 ABR threshold of intact RWM group at two weeks post operation and pre-operation

表2 完整圓窗膜途徑組動物術(shù)后兩周和術(shù)前術(shù)耳ABR閾值（±s，dB SPL）Table 2 ABR threshold of intact RWM group at two weeks post operation and pre-operation

CLICK 4K 8K 12K 24K 38.89±4.86 43.33±5.00 31.67±7.07 20.56±6.82 41.11±8.21 36.67±5.59 42.22±7.55 31.67±8.66 23.33±7.07 43.89±7.82 0.80 0.39 0.00 0.76 0.81 0.45 0.70 1.00 0.47 0.44

2.2 術(shù)后兩周耳蝸解剖肉眼觀察

術(shù)后兩周兩組術(shù)后耳蝸中耳腔、內(nèi)耳無滲液、出血情況，與對側(cè)耳比較無明顯差異。圓窗膜完整，圓窗龕無炎性滲出物。

2.3 內(nèi)耳GFP表達情況

激光共聚焦顯微鏡下觀察，圓窗膜顯微注射組內(nèi)毛細胞呈現(xiàn)明亮的自發(fā)綠色熒光(圖A-F)，底轉(zhuǎn)較強，且只在內(nèi)毛細胞有表達，每200μm區(qū)域GFP陽性細胞底轉(zhuǎn)為（25.6±1.85，n=5），中轉(zhuǎn)為（16.6±1.85，n=5），頂轉(zhuǎn)為（3.8 ±1.67，n=5）。完整圓窗膜途徑組及對側(cè)耳無自發(fā)綠色熒光，GFP抗體復(fù)染后仍觀察不到綠色熒光（圖E、F）。9型AAV病毒難以透過完整的圓窗膜轉(zhuǎn)染內(nèi)耳，和Mhatre等研究結(jié)果一致[11]。DAPI核染觀察均未見內(nèi)毛細胞缺失情況。

圖2 9型AAV在圓窗膜顯微注射組耳蝸內(nèi)毛細胞選擇性表達（A-F），箭頭所指為轉(zhuǎn)染陽性的內(nèi)毛細胞(A圖為底轉(zhuǎn)基底膜GFP自發(fā)熒光、B圖為A和DAPI核染后疊加、C圖為中轉(zhuǎn)基底膜GFP自發(fā)熒光、D圖為頂轉(zhuǎn)基底膜GFP自發(fā)熒光、E和F圖為耳蝸切片不同層面GFP自發(fā)熒光);完整圓窗膜途徑組及對側(cè)耳無自發(fā)綠色熒光，GFP抗體復(fù)染后仍觀察不到綠色熒光（圖G、H）A-H x20.Fig.2 Transduced IHCs throughout the cochlea in adult mice of microinjection group and intact RWM group，the arrow points to transfected positive hair cells.

3 討論

耳蝸位于顳骨深部以及血迷路屏障的存在，目前內(nèi)耳仍無有效局部用藥方式和途徑，無論是藥物治療還是基因?qū)耄x擇合適的導(dǎo)入途徑是耳聾治療的重要基礎(chǔ)。本實驗通過比較顯微注射圓窗膜及透過完整圓窗膜兩種方式AAV轉(zhuǎn)染內(nèi)耳的情況，對其可行性、轉(zhuǎn)染效率以及對聽力的影響進行研究，為基因治療和內(nèi)耳轉(zhuǎn)導(dǎo)在臨床應(yīng)用打下研究基礎(chǔ)。

我們在實驗中觀察到9型AAV病毒難以通過完整的圓窗膜，圓窗膜作為中耳和內(nèi)耳的屏障發(fā)揮著重要作用，文獻報道AAV感染宿主細胞需要特定的受體[12-13]，可能由于圓窗膜上缺乏AAV病毒特定受體介導(dǎo)而被阻隔。顯微注射刺破圓窗膜可觀察到9型AAV轉(zhuǎn)染內(nèi)毛細胞，且底轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染效率最高可達到100%，從底轉(zhuǎn)到頂轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染效率逐漸下降。9型AAV特異性轉(zhuǎn)染內(nèi)毛細胞，而不轉(zhuǎn)導(dǎo)外毛細胞，這和YI Laishu[10]研究結(jié)果相符，但本研究并未觀察到支持細胞有自發(fā)熒光表達，9型AAV可作為特異性干擾或者上調(diào)內(nèi)毛細胞中蛋白和基因的靶向性載體。

研究中兩種方式均未引起小鼠耳蝸ABR閾值顯著性改變（P＞0.05，詳見表1、表2），耳后入路聽泡后壁打孔手術(shù)操作創(chuàng)傷小，對耳蝸正常結(jié)構(gòu)和生理功能影響較小，這與陳偉等[9]報道的在豚鼠耳蝸的操作一致。本研究中采用直徑約10-15um的玻璃電極顯微刺破圓窗膜，可見到淋巴液流出，待流出穩(wěn)定后注射AAV，后取肌肉組織滴加組織粘合劑封閉圓窗龕，并未引起ABR閾值大幅度上調(diào)，術(shù)后兩周ABR閾值較術(shù)前有上移，閾移在10dB以內(nèi)，差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義。可能的原因有：手術(shù)操作小心，術(shù)中無大量出血情況，手術(shù)操作時程控制在30min內(nèi)；顯微微量電極注射針頭直徑小（10-15um），對圓窗膜造成的創(chuàng)傷?。辉缙诹馨鸵和饬髡T導(dǎo)的淋巴管周圍容積在耳的固定容積內(nèi)的變化導(dǎo)致靜水壓力改變從而使耳蝸導(dǎo)水管驅(qū)動代償性容積變化[14-15]，得到腦脊液的及時補償作用；注射過程持續(xù)5min，減少液體進入鼓階對基底膜的沖擊作用；組織粘合劑將肌肉組織封閉圓窗龕，有助于減少外淋巴液進一步持續(xù)外流；注射AAV量為1ul[8]，超過1ul增加聽力損失風(fēng)險。對側(cè)耳蝸是否被轉(zhuǎn)染不能確定，本實驗未觀察到AAV轉(zhuǎn)染對側(cè)耳蝸，在AV轉(zhuǎn)染豚鼠耳蝸的文獻[16]中報道增加病毒用量可以觀察到對側(cè)耳蝸轉(zhuǎn)染的情況，耳蝸導(dǎo)水管-腦脊液循環(huán)到對側(cè)耳為其可能的原因。增加AAV用量會增加聽力受損的風(fēng)險，在以后的研究中可以嘗試在其它大型動物如小型豬等增加AAV用量，觀察是否能進入對側(cè)耳，為單側(cè)基因?qū)胫委熾p側(cè)耳聾打下基礎(chǔ)。

本研究的不足之處，只研究了9型AAV對內(nèi)耳的轉(zhuǎn)染情況，其它亞型有待進一步研究，特別是克服了人中和抗體影響的新血清型AAV載體（bAAV）[17]；由于頂轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染效率較低，尚需進一步嘗試新的手術(shù)入路，以尋求更高的轉(zhuǎn)染效率，如半規(guī)管入路[18]等，國內(nèi)尚未有相關(guān)文獻報道。由于小鼠聽覺發(fā)育成熟較晚，解剖結(jié)構(gòu)和人類相差較大，小型豬是實驗動物中除靈長類外和人類進化關(guān)系最近的物種，與人類在內(nèi)耳各器官的解剖結(jié)構(gòu)相似，小型豬作為耳科領(lǐng)域的新興動物模型將為耳科學(xué)及聽力學(xué)的相關(guān)研究，為人類聾病的防治提供最理想的實驗?zāi)Ｐ图罢撟C[19-20]，因此，在小型豬等大動物模型上進一步驗證該手術(shù)入路對耳蝸的轉(zhuǎn)染效率以及對聽力的影響是進一步研究的方向。