朱穎濤 郭燕 喬巖巖 韓江偉

鄭州大學附屬兒童醫(yī)院/河南省兒童醫(yī)院/鄭州兒童醫(yī)院1藥學部，2住院管理處（鄭州 450018）；河南醫(yī)學高等?？茖W校藥學系（鄭州 451191）

哮喘是一種發(fā)病機制復雜的常見呼吸道疾病，尤其是兒童支氣管哮喘，發(fā)病率逐年上升，已成為全球關(guān)注的公眾健康問題。氣道炎癥、氣道重塑是哮喘重要的病理特征［1]，也是導致中重度哮喘不可逆性和治療困難的原因。β-腎上腺素受體激動劑及糖皮質(zhì)激素可使氣道炎癥和急性氣道高反應得到緩解，但患者仍經(jīng)常發(fā)生氣道重塑，肺功能下降，因此防治哮喘氣道炎癥及控制氣道重塑具有重要意義。研究表明，Wnt/β-catenin信號通路參與氣道平滑肌細胞的增殖、遷移、分化［2]，而氣道平滑肌細胞在氣道炎癥與氣道重塑中扮演著重要角色。馬鞭草苷是中藥馬鞭草的主要成分，具有抗炎、鎮(zhèn)咳等生物活性［3]，但其對哮喘的作用及機制尚不明確。本研究通過哮喘大鼠模型，檢測馬鞭草苷對哮喘大鼠肺泡灌洗液中白細胞和炎癥因子的影響，觀察肺組織病理學和β-連環(huán)蛋白（β-catenin）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的表達，評價馬鞭草苷對哮喘大鼠氣道炎癥及氣道重塑的作用，探討馬鞭草苷治療哮喘的內(nèi)在機制，為治療相關(guān)疾病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料馬鞭草苷（成都瑞芬思生物科技有限公司）；卵清白蛋白（OVA，美國Sigma公司）；白介素4（IL-4）、白介素5（IL-5）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；β-catenin、GSK-3β多克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）。

1.2 動物模型建立與干預8周齡雄性SD大鼠，50只，購于河南省實驗動物中心，隨機分為正常（Con）組、模型（Mod）組、馬鞭草苷低（VL，20 mg/kg）、中（VM，40 mg/kg）和高劑量（VH，80 mg/kg）組，每組10只。除正常組外，在第1天和第8天腹腔注射OVA（1 mg）與氫氧化鋁凝膠（100 mg）混合液致敏［4]，第2天開始各組灌胃相應藥物，正常組和模型組灌胃蒸餾水，從第15天開始灌胃后30 min以1%OVA霧化激發(fā)，每次30 min，隔天1次，連續(xù)4周。

1.3 肺泡灌洗液（BALF）中細胞因子和白細胞檢測末次激發(fā)后2 h麻醉大鼠，打開胸腔暴露肺組織，氣管插管，分離肺組織，結(jié)扎右主支氣管，用5 mL生理鹽水分2次于氣管插管處注入，緩慢沖洗左肺，并按摩肺組織，約30 s后回收BALF，回收率在80%左右，將回收的BALF于4℃2 000 r/min離心10 min，ELISA法按試劑盒說明檢測BALF中IL-4、IL-5、TNF-α的含量；沉渣用1 mL生理鹽水懸浮，進行BALF細胞涂片，進行細胞計數(shù)及分類。

1.4 肺組織病理學觀察取右肺近肺門組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，進行HE染色，每只大鼠隨機選3張肺組織切片，每張切片以單盲法選取5支支氣管顯微鏡下觀察。應用Lecia Qwin V3圖像分析軟件測量肺組織支氣管基底膜周徑（Pbm），基底膜厚度和支氣管平滑肌厚度。

1.5 Werstern blot檢測取200 mg肺組織提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取適量蛋白煮沸變性，15%SDS-PAGE凝膠電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，脫脂奶粉封閉，漂洗后加β-catenin或GSK-3β抗體4℃過夜，漂洗后以辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h，漂洗后ECL曝光成像，用Image-Pro Plus 6.0軟件分析，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin的積分光密度的比值作為蛋白的表達。

1.6 統(tǒng)計學方法采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組間的比較采用單因素ANOVA檢驗和多重比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 BALF中細胞計數(shù)及細胞分類與Con組比較，模型組BALF中細胞總數(shù)、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞增多，巨噬細胞減少（P＜0.05）。與Mod組比較，VM、VH組BALF中細胞總數(shù)、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞減少，巨噬細胞增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 BALF中細胞因子與Con組比較，模型組BALF中IL-4、IL-5和TNF-α顯著升高（P＜ 0.05）。與Mod組比較，VM、VH組BALF中IL-4、IL-5和TNF-α水平降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表1 馬鞭草苷對大鼠BALF中細胞總數(shù)及分類的影響Tab.1 Changes of total cellular score and cellular classification in BALFof rats（n=10） ± s

表1 馬鞭草苷對大鼠BALF中細胞總數(shù)及分類的影響Tab.1 Changes of total cellular score and cellular classification in BALFof rats（n=10） ± s

注：與對照組比較，*P＜0.05；與Mod組比較，▲P＜0.05

組別Con組Mod組VL組VM組VH組細胞總數(shù)（108/L）2.68±0.81 7.43±1.56*6.02±1.35*4.96±1.14*▲3.89±1.06▲中性粒細胞（%）9.87±1.61 14.15±2.09*12.70±1.82*10.97±1.57▲10.36±1.60▲淋巴細胞（%）7.56±1.32 11.91±1.76*10.23±1.63*8.73±1.46 8.27±1.41▲巨噬細胞（%）81.38±3.76 66.71±3.21*71.17±3.09*76.45±3.28▲78.21±3.40▲嗜酸性粒細胞（%）1.18±0.53 7.22±1.26*5.89±1.03*▲3.84±0.80*▲3.15±0.71*▲

2.3 肺組織病理形態(tài)學HE染色顯示，Con組肺組織未見異常，無氣道重塑表現(xiàn)及炎性細胞浸潤；Mon組支氣管管腔狹窄，支氣管壁厚度和平滑肌厚度明顯增加，支氣管、黏膜下及肺泡間質(zhì)大量炎性細胞浸潤；與Mon組比較，馬鞭草苷各組炎性反應及氣道重塑表現(xiàn)改善。見圖1和表3。

2.4 肺組織β-catenin或GSK-3β表達Westernblot顯示，與Con組比較，Mon組肺組織β-catenin蛋白表達增加，GSK-3β表達減少（P＜0.05）；與Mon組比較，VM、VH組大鼠肺組織中β-catenin表達減少，GSK-3β表達增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖2和表4。

表2 馬鞭草苷對大鼠BALF中細胞因子的影響Tab.2 Effect of verbenalin on the content of cytokine in BALFof rats（n=10）± s，ng/L

表2 馬鞭草苷對大鼠BALF中細胞因子的影響Tab.2 Effect of verbenalin on the content of cytokine in BALFof rats（n=10）± s，ng/L

組別Con組Mod組VL組VM組VH組IL-4（ng/L）12.1±2.6 34.7±5.4*26.6±3.8*22.4±3.3*▲20.2±3.5*▲IL-5（ng/L）19.2±3.6 37.5±5.8*32.1±5.3*28.6±4.6*25.0±3.8▲TNF-α（ng/L）41.6±6.9 114.8±14.5*102.7±16.7*83.2±10.4*▲71.9±11.6*▲

3 討論

圖1 各組大鼠的肺組織病理（HE，×200）Fig.1 Pathomorphology of lung tissues in asthmatic rats（HEstaining，× 200）

表3 各組大鼠支氣管基底膜周徑、管壁厚度和平滑肌厚度Tab.3 Results of perimeter of basement membrane and thicknesses of bronchial wall and airwaysmooth muscle in different groups（n=10） ± s，μm

表3 各組大鼠支氣管基底膜周徑、管壁厚度和平滑肌厚度Tab.3 Results of perimeter of basement membrane and thicknesses of bronchial wall and airwaysmooth muscle in different groups（n=10） ± s，μm

注：與對照組比較，*P＜0.05；與Mod組比較，▲P＜0.05

組別Con組Mod組VL組VM組VH組基底膜周徑2 159±171 2 282±219 2 128±188 2 263±227 2 193±206支氣管壁厚度32.68±4.19 87.95±19.10*68.76±16.35*▲56.60±12.28*▲49.71±9.07*▲平滑肌厚度8.39±1.09 25.93±2.36*19.13 ± 2.20*▲16.59 ± 1.85*▲14.34 ± 1.51*▲

圖2 大鼠肺組織中β-catenin和GSK-3β的蛋白表達Fig.2 The protein expression ofβ-catenin and GSK-3β in lung of rats

本實驗使用OVA對大鼠進行致敏，再用OVA進行霧化攻擊復制哮喘模型，從肺泡灌洗液中白細胞總數(shù)及分類、細胞因子、肺組織病理學考察模型的成功性。結(jié)果顯示，模型大鼠支氣管肺泡灌洗液中的白細胞總數(shù)明顯增加，白細胞分類發(fā)現(xiàn)嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞的比例提高。嗜酸性粒細胞和中性粒細胞是哮喘發(fā)病中的關(guān)鍵因素［5]，哮喘急性發(fā)作和慢性氣道炎癥均伴隨著嗜酸性粒細胞和中性粒細胞的大量浸潤和聚集。哮喘的發(fā)展由炎癥前細胞因子介導，主要包括Th2細胞分泌的IL-4、IL-5及Th1細胞分泌的TNF-α［6]。本研究顯示檢測模型大鼠的肺泡灌洗液中細胞因子IL-4、IL-5、TNF-α較正常大鼠明顯升高，肺組織病理學發(fā)現(xiàn)大鼠支氣管管腔狹窄，支氣管壁厚度和平滑肌厚度明顯增加，支氣管、黏膜下及肺泡間質(zhì)大量炎性細胞浸潤。本實驗所復制的大鼠模型表現(xiàn)出典型的氣道炎癥和氣道重塑，而氣道炎癥、氣道重塑是哮喘重要的病理特征。

表4 大鼠肺組織中β-catenin和GSK-3β的表達Tab.4 The protein expression ofβ-catenin and GSK-3β in lung of rats（n=10） x ± s

馬鞭草苷為環(huán)烯醚萜苷類物質(zhì)，是馬鞭草中主要的極性成分，具有鎮(zhèn)咳［7]、促進血管新生［8]、保護心臟［9]等生物活性。本研究發(fā)現(xiàn)馬鞭草苷可降低哮喘大鼠肺泡灌洗液中炎癥細胞因子IL-4、IL-5、TNF-α的水平，減少白細胞總數(shù)，降低嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞的比例。肺組織病理學顯示馬鞭草苷可改善哮喘大鼠支氣管管腔狹窄、黏膜下及肺泡間質(zhì)炎性細胞浸潤、支氣管壁厚度和平滑肌厚度增加的病理表現(xiàn)。有研究證實馬鞭草苷的鎮(zhèn)咳、抗炎活性，但馬鞭草苷對哮喘引起的氣道炎癥和氣道重塑的影響未見報道。本實驗通過OVA致敏大鼠建立哮喘模型，發(fā)現(xiàn)馬鞭草苷可抑制哮喘大鼠的氣道炎癥和氣道重塑。

Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號通路與哮喘的關(guān)系十分密切，其可調(diào)控氣道平滑肌細胞（ASMC）的增殖和分化功能。ASMC的增殖和遷移不僅是氣道發(fā)生重塑的關(guān)鍵因素［11]，還是多種炎癥介質(zhì)釋放的來源［12]。Wnt/β-catenin信號通路通過調(diào)節(jié)其下游核內(nèi)原癌基因c-Myc及細胞周期蛋白D1調(diào)控ASMC的增殖、分化、遷移等，參與哮喘氣道炎癥和氣道重塑的病理過程［13-14]。β-catenin是Wnt通路中的核心蛋白，而糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）調(diào)控β-catenin的降解，Wnt信號通路是否激活取決于GSK-3β水平［15]。本研究顯示哮喘大鼠肺組織中β-catenin蛋白表達增加，GSK-3β表達減少，馬鞭草苷可抑制哮喘大鼠肺中β-catenin表達，增加GSK-3β表達。馬鞭草苷可能通過Wnt/β-catenin信號通路影響ASMC，進而抑制炎癥介質(zhì)的釋放和氣道重塑的發(fā)展，發(fā)揮抗哮喘的作用。

本研究初步證實了馬鞭草苷可能通過Wnt/βcatenin信號通路抑制哮喘大鼠的氣道炎癥和氣道重塑，但馬鞭草苷對下游信號分子的影響如何，其對ASMC增殖、遷移及分化的作用仍需深入探索。在下一步研究中，我們將結(jié)合體外細胞實驗，分離哮喘大鼠ASMC，檢測馬鞭草苷對Wnt/β-catenin信號通路下游信號分子原癌基因c-Myc和細胞周期蛋白D1的影響，檢測ASMC的增殖遷移，進一步闡明馬鞭草苷抑制哮喘引起的氣道炎癥和氣道重塑的作用及機制。