王鶴 李江 黃興文 黃詩婭

【摘 要】 目的：正交設計實驗優(yōu)化吉祥草配伍余甘子的提取工藝。方法：采用紫外分光光度法和高效液相色譜法，測定總皂苷、總黃酮及沒食子酸的含量；配伍后以總皂苷、總黃酮、沒食子酸含量為指標，考察浸泡時間、60%乙醇用量、提取滲漉速度三因素三水平。結果：配伍提取工藝影響因素滲漉速度>溶劑用量>浸泡時間。最佳工藝為藥材經過浸潤后浸泡4h，提取溶劑用量為15倍量，滲漉速度為1mL/min。結論：考察優(yōu)化了吉祥草配伍余甘子提取方法，該方法簡便穩(wěn)定性好，可用于吉祥草配伍余甘子復方制劑的質量控制。

【關鍵詞】 吉祥草配伍余甘子；總皂苷；沒食子酸；總黃酮；提取工藝

【中圖分類號】R284.2 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2018）02-0033-06

Abstract：Objective Orthogonal design experiment to optimize the extraction process of Reineckea carnea and Phyllanthus emblica L.Methods Measuring total saponins，total flavonoids and gallic acid content by Ultraviolet Spectrophotometry and High Performance Liquid Chromatography.Results The content of total saponins is 1.4%， the gallic acid， total flavonoids are respectively 3.34%， 8.28%， Extraction process influencing is factors Extraction speed > Solvent dosage > Soaking time.Conclusion The factors had no significant effect on the experimental results.Taking into account all aspects of factors，The final choice of the best process： the medicine after immersion 4h， the amount of solvent extraction 15 times the amount of percolation speed of 1mL / min.

Keywords：Reineckea Carnea and Phyllanthus Emblica L.；Total Saponins；Gallic Acid；Total Flavonoids；Extraction Process

吉祥草與余甘子均為貴州十大苗藥，藥用資源廣泛。吉祥草為百合科植物Reineckea carnea （Aner.） Kunth的干燥全草[1-3]，在貴州、湖南、廣西等苗族人口主要聚集區(qū)使用較為廣泛[4]，具有滋陰潤肺、涼血止血、解毒利咽之功效，用于肺燥咳喘，陰虛咳嗽，咳血，治療肺熱咳嗽，跌打損傷，瘡毒等[5]。余甘子為大戟科葉下珠屬（Phyllanthus）植物余甘子Phyllanthus emblica L.的干燥成熟果實[6]，系藏、苗族民間常用藥[7]，具有清熱涼血，消食健胃，生津止渴之功效。用于血熱血瘀，消化不良，腹脹，咳嗽，喉痛，口干。吉祥草長于解毒清肺止咳，余甘子長于清熱潤肺化痰，兩藥相需配伍共奏清熱解毒、潤肺止咳化痰之功。課題組調查發(fā)現(xiàn)民間將兩藥配伍應用，用于治療肺癌具有較好的療效。為了進一步提高兩藥配伍療效，實驗建立總皂苷、總黃酮、沒食子酸的含量測定方法，采用正交設計實驗優(yōu)化吉祥草配伍余甘子提取工藝。

1 儀器與材料

1.1 儀器 日立Primaide高效液相色譜儀（天美科學儀器有限公司）； JA2003N電子分析天平；721型可見分光光度計。

1.2 材料 吉祥草采于貴州六枝縣，經貴陽中醫(yī)學院生藥教研室孫慶文教授鑒定為百合科吉祥草屬植物吉祥草 Reineckia carnea （Andr.）Kunth 的帶根全草；余甘子產地為貴州晴隆縣，藥材經貴陽中醫(yī)學院生藥教研室孫慶文教授鑒定為大戟科葉下珠屬（Phyllanthus）植物余甘子 Phyllanthus emblica L.的成熟果實。吉祥草、余甘子對照藥材購自中國藥品生物制品鑒定所；薯蕷皂苷購自成都曼斯特生物科技有限公司；沒食子酸購自中國藥品生物制品鑒定所；蘆丁對照品購自成都瑞芬思生物科技有限公司。

2 方法及結果

2.1 總皂苷含量測定[8]2.1.1 供試品溶液的制備 精密稱定配伍藥材（吉祥草∶余甘子=2∶1）粗粉5.0 g，甲醇回流提取4 h，回收甲醇，加入蒸餾水使之溶解，濾過，濾液轉移至100 mL的容量瓶中加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。準確吸取10 mL于分液漏斗中，用石油醚分6次萃取，每次用量分別為15、10、10、10、10、10 mL，取水層用水飽合正丁醇溶液萃取4次，每次用量分別為15、10、10、10 mL，合并正丁醇萃取液并用正丁醇飽和水溶液20 mL洗滌，回收正丁醇液至干，殘渣用甲醇溶解并定容于25 mL容量瓶中，作為供試品溶液。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取薯蕷皂苷對照品（干燥至恒重）1.21 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為對照品溶液（121 μg/mL）。

2.1.3 測定波長的選擇 分別精密吸取對照品溶液1.5 mL、供試品溶液0.6 mL置于具塞試管中，揮干甲醇，再分別加入5%的香草醛冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，搖勻，密塞，于60℃水浴顯色15 min，取出后立即用冰水冷卻5 min，再加入5 mL冰醋酸稀釋，搖勻，靜置10 min，在200～900nm進行掃描，結果如圖1、圖2所示。兩者均在460 nm處，有最大吸收峰。

2.1.4 線性關系考察 分別精密移取薯蕷皂苷對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL置于具塞試管中，揮干甲醇，再分別加入5%的香草醛冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，搖勻，密塞，60℃水浴顯色15 min，取出后立即用冰水冷卻5 min，再加入5 mL冰醋酸稀釋，搖勻，靜置10 min，于460 nm處測定其吸光度。以吸光度（A）為縱坐標，質量濃度（C）為橫坐標進行線性回歸，回歸方程為：y=0.0251x-0.0190（R=0.9996，n=6），結果表明：薯蕷皂苷在4～24μg/mL濃度范圍與吸光度成良好的線性關系，如圖3所示。

2.1.5 精密度試驗 吸取對照液0.8 mL，共6份，按2.1.3項下的操作方法顯色，于460 nm處測定吸光度，計算RSD=1.71%，結果表明方法的精密度良好，見表1。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取樣品溶液0.4 mL，按2.1.3項下的操作方法顯色，于460 nm處分別在0、15、30、45、60、90、120 min測定吸光度，結果表明樣品液顯色后在120 min內穩(wěn)定，RSD=0.86%，結果見表1。

2.1.7 重復性試驗 精密稱取同一批配伍藥材6份，每份5g，按2.1項下方法制備供試品溶液，另取供試品溶液0.4 mL按2.1.3項下操作方法顯色，于460 nm處測定吸光度，并計算含量，結果平均含量為1.40%，RSD=1.50%。結果表明方法的重復性良好。

2.1.8 加樣回收試驗 精密稱取2.1.7項下已知含量的同一批次配伍藥材2.5g，共6份，分別加入等量薯蕷皂苷對照品適量，按2.1.3項下的操作方法顯色，于460 nm處測定吸光度，結果見表2。

2.2 沒食子酸含量測定[9-10]2.2.1 色譜條件 色譜柱：Venusil XBP C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇：0.3%磷酸水（4∶96）；柱溫：30℃；流速：1 mL/min；檢測波長：273 nm。理論塔板數(shù)按沒食子酸峰計算，應不低于2000。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱定配伍藥材（吉祥草：余甘子=2∶1）粗粉0.2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定重量，回流1 h，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，過0.45 μm微孔濾膜，作為供試品溶液。

2.2.3 對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸對照品0.026 20 g，置于25 mL容量瓶中，用50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取0.7 mL上述溶液于10 mL容量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL含73.36 μg的對照品溶液。

2.2.4 線性關系考察 精密吸取上述溶液0.2、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL分別置于10 mL容量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻。按上述色譜條件，進樣體積10μL，測定沒食子酸峰面積。其HPLC出峰情況見圖4。以沒食子酸峰面積值Y為縱坐標，進樣量X（μg）為橫坐標，求得沒食子酸標準曲線回歸方程和線性相關系數(shù)分別為Y=3 159.3X-53 921（r=0.999 5），結果表明沒食子酸進樣量在0.419 2～0.943 2 μg內線性關系良好，結果如圖5所示。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液，連續(xù)重復進樣6次，每次10 μL，記錄峰面積，結果表明，RSD為1.39，小于3%，表明儀器的精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，在上述色譜條件下，分別于0、1、3、6、9、12 h時進樣，記錄峰面積，結果表明，峰面積的RSD值為0.98%，表明樣品溶液在室溫條件下12 h內基本穩(wěn)定。結果見表4。

2.2.7 重復性試驗 精密稱取同一批配伍藥材6份，按“2.2.2”項下進行操作，制成供試品溶液，測定沒食子酸的含量 （mg/g），結果平均含量為32.477 mg/g，RSD為1.29%，表明重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密稱取2.2.7項下已知含量的同一批次配伍藥材2.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入1.048 mg/mL的沒食子酸對照品溶液1.1 mL，按“2.2.2”項下供試品溶液制備項下方法制備供試液，在上述色譜條件下測定沒食子酸含量，計算平均加樣回收率和RSD。結果樣品中沒食子酸的平均回收率為98.11%，RSD為2.40%。結果見表5。

2.3 總黃酮含量測定[11]2.3.1 供試品溶液制備 精密稱定配伍藥材（吉祥草：余甘子=2∶1）粗粉0.5 g，精密加入60%乙醇50mL，回流提取1.5h，取出，放冷，用60%乙醇補足減失的重量，濾過，濾液作為供試品溶液，備用。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品5.12mg，60%乙醇微熱溶解并定容至25mL，搖勻，得濃度為0.2048mg/mL的對照品溶液。

2.3.3 最大吸收波長的測定 準確吸取蘆丁對照品溶液1.0mL，置于具塞試管中，加入60%乙醇至5mL，再加入5%亞硝酸鈉0.3mL搖勻，放置6min；加入10%硝酸鋁0.3mL搖勻，放置6min；加入1%NaOH溶液4mL；加水0.4mL，搖勻后放置15min，在200～800nm處進行最大吸光度的掃描。結果表明波長在508nm處有最大吸光度。

2.3.4 線性關系考察 準確吸取蘆丁對照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0于6只具塞試管中，分別加入體積分數(shù)為60%乙醇溶液至5mL；加入5%亞硝酸鈉0.3mL搖勻，放置6min；加入10%硝酸鋁0.3mL搖勻，放置6min；加入1% NaOH溶液4mL；加入水0.4mL，搖勻后放置15min，以0.0mL作為空白，于508nm處測定各自吸光度，并以蘆丁含量的濃度作為橫坐標，以該濃度下所測定的吸光度作為縱坐標，繪制標準曲線并求出該標準曲線下對應的回歸方程，回歸方程和相關系數(shù)分別為：Y=10.493X-0.012，R2=0.9996，結果表明，蘆丁在0.02～0.10mg/mL范圍內呈良好的線性關系。如圖6所示。

2.3.5 精密度試驗 精密吸取蘆丁對照品溶液2mL，共6份，按“2.3.3”項下顯色方法顯色，于508nm處測定吸光度，結果見表，計算吸光度RSD值為1.77%。結果表明，該方法精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取供試品溶液0.4mL，按“2.3.3”項下顯色方法顯色，于508nm處分別在0，15，30，45，60，90min測定吸光度，結果見表7；計算吸光度RSD值為1.16%。結果表明，該方法表明樣品溶液在90min內基本保持穩(wěn)定，所以，應該在樣品顯色后90min內進行吸光度的測定。結果見表6。

2.3.7 重復性試驗 精密稱取2.3.6項下已知含量的同一批次配伍藥材6份，按“2.3.1”項下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，取0.4mL供試品溶液照“2.3.4”項下標準曲線的制備方法，自“加入60%乙醇溶液至5mL”起，依法測定吸光度，計算含量，結果平均含量為8.75%，RSD為2.01%，表明重復性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗 精密稱取2.3.7項下已知含量的同一批配伍藥材2.5g，共6份，精密加入5mL濃度為4.32mg/mL的蘆丁標準品溶液，搖勻，按供試品制備方法制備供試品溶液，取供試品溶液樣品1mL，照標準曲線的制備項下的方法，自“加入60%乙醇溶液至5mL”起，依法測定吸光度。結果計算回收率為96.62%，RSD為1.48%。結果見表7。

2.4 供試品提取工藝優(yōu)化

2.4.1 因素與水平設計 前期對吉祥草配伍余甘子不同提取物及有效部位組合藥效學進行比較研究后，篩選出最佳提取方法為60%乙醇滲漉提取，為使有效部位中各有效成分最大程度的富集，以浸泡時間、60%乙醇用量、滲漉速度作為因素，每個因素設3個水平，最后以總皂苷含量、沒食子酸含量、總黃酮含量總和以及得膏率為評價指標，采用L9（34）正交試驗設計篩選最佳的有效部位提取方法，分析見表8。

2.4.2 正交試驗及結果 稱取吉祥草36g，余甘子18g，浸泡前先用60%乙醇54mL浸潤30min。分別按表8條件進行試驗，制得共9號干膏。吉祥草配伍余甘子滲漉提取工藝中各因素對結果影響的主次順序為：C>B>A。具方差分析結果可知，各因素對實驗結果沒有顯著的影響，綜合考慮各方面因素，實驗最終選擇最佳的滲漉工藝為：A1B2C1即藥材經過浸潤后浸泡4h，提取溶劑用量為15倍量，滲漉速度為1mL/min。

總評分=（含量總和測定值/含量總和最大值）×65+（得膏率測定值/得膏率最大值）×35

2.4.3 驗證實驗 稱取吉祥草36g，余甘子18g，3批，浸泡前先用60%乙醇54mL浸潤30min后浸泡4h，用提取溶劑用為15倍量滲漉，滲漉速度為1mL/min，滲濾液減壓干燥得干膏，按上述建立含量測定方法進行含量測定，表明含量測定符合優(yōu)選出的工藝，工藝穩(wěn)定，合理可行。結果見表11。

3 討論

吉祥草與余甘子（2∶1）配伍，分別采用不同的提取方法，所得浸膏配成藥液后作用于非小細胞肺癌實驗動物模型，結果對腫瘤模型小鼠生活質量有不同程度的改善，其中60%乙醇滲漉提取法優(yōu)于其他方法。研究顯示，60%乙醇滲漉提取部位能夠較大程度的富集黃酮、皂苷等主要抗腫瘤成分，故采用60%乙醇滲漉法提取。為使最佳提取部位中各有效成分最大程度富集，以浸泡時間、60%乙醇用量以及滲漉速度作為因素，并以沒食子酸含量、總黃酮含量、總皂苷含量總和以及得膏率作為評價指標，采用L9（34）正交試驗設計優(yōu)化60%乙醇滲漉提取工藝。最終選擇最佳條件是藥材浸潤后浸泡4h，提取溶劑用量為15倍量，滲漉速度為1mL/min。

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