李曉菲，陳 婷，魏笑笑，孫愛榮，秦立廷

（山東新希望六和集團(tuán)有限公司，山東 青島 266000）

豬偽狂犬?。≒seudorabies，PR）是由豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的一種豬的烈性傳染病。PRV可感染各個(gè)年齡段的豬，臨床癥狀主要表現(xiàn)為種豬不育、仔豬高死亡率以及妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎。隨著PRV變異毒株的出現(xiàn)以及近年來(lái)養(yǎng)豬業(yè)的快速發(fā)展，我國(guó)PR的發(fā)生與流行日益增多，目前許多規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)的PRV野毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，其他中小規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)以及個(gè)體戶養(yǎng)殖場(chǎng)的野毒感染情況更加嚴(yán)重，從而給該病的防治帶來(lái)很大的困難。因此對(duì)PRV野毒感染尤其是感染早期的快速、準(zhǔn)確診斷對(duì)PRV的種群凈化以及PR的防控具有重要意義。

gE基因是OIE規(guī)定的偽狂犬基因缺失苗的缺失基因，因此基于gE基因建立相應(yīng)的鑒別診斷方法可以區(qū)分PRV野毒和疫苗毒。本研究旨在gE基因序列上設(shè)計(jì)引物與探針，建立一種可區(qū)分PRV基因缺失疫苗株和野毒感染的熒光定量檢測(cè)方法，為PRV感染初期的快速準(zhǔn)確診斷及其流行病學(xué)調(diào)查提供可靠的技術(shù)工具。

1 材料與方法

1.1 病毒與臨床樣品來(lái)源 豬瘟病毒（CSFV），豬流行性腹瀉病毒（PEDV），豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV），豬輪狀病毒（RV），豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV），豬細(xì)小病毒（PPV）、豬偽狂病病毒（PRV）和豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）等由新希望六和動(dòng)保中心青島中心實(shí)驗(yàn)室保存。疑似PRV感染病料，由新希望六和動(dòng)保中心青島中心實(shí)驗(yàn)室在山東、河北等地的養(yǎng)豬場(chǎng)收集。

1.2 儀器與試劑 熒光定量PCR儀、分光光度計(jì)、核酸提取試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、PCR酶、Premix Ex Taq（Probe qPCR）等。

1.3 引物探針設(shè)計(jì)與合成 通過對(duì)多個(gè)PRV毒株gE基因序列進(jìn)行比較分析，在其保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和Taq-Man探針。上、下游引物序列分別為Primer F:5'CGGCTTCGACGTCTGGTT 3'和 Primer R: 5' GCCATAGTTGGGTCCATTCG 3'。探針序列為5'FAM-CCGGAGAAACCGGAAG-MGB 3'，其中5'端標(biāo)記 FAM，3'端標(biāo)記MGB。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品制備 將PRV gE目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將目的片段回收純化，與pMD19-T載體連接后進(jìn)行轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒，經(jīng)鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒即為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。將標(biāo)準(zhǔn)品濃度換算成拷貝數(shù)，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 反應(yīng)條件優(yōu)化 首先通過溫度梯度PCR確定引物的最適退火溫度，然后用矩陣法對(duì)探針和引物的用量進(jìn)行摸索與改進(jìn)，最終獲得最適合的探針引物濃度配比，確定反應(yīng)體系。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將1.4中制備的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍連續(xù)倍比稀釋，稀釋后對(duì)9.2×101～9.2×109copiesμL-1濃度范圍的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 特異性試驗(yàn) 利用建立的熒光定量方法對(duì)CSFV，PEDV，TGEV，RV和PRRSV的cDNA以及PPV和PCV2的DNA進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證該方法的特異性。

1.8 敏感性試驗(yàn) 將陽(yáng)性DNA進(jìn)行連續(xù)10倍倍比稀釋至最低濃度為1.12×101copiesμL-1，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。同時(shí)以該DNA為模板，進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)，比較兩種檢測(cè)方法的敏感性。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn) 用5種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒分別進(jìn)行4次批內(nèi)和批間的重復(fù)性試驗(yàn)并且根據(jù)Ct值計(jì)算變異系數(shù)。

1.10 對(duì)臨床樣品的檢測(cè) 由本實(shí)驗(yàn)室收集可疑PRV臨床樣品60份，分別進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)和常規(guī)PCR檢測(cè)，比較分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 通過常規(guī)PCR擴(kuò)增PRVgE目的基因，將擴(kuò)增的目的片段純化后與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒，經(jīng)鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒即為熒光定量標(biāo)準(zhǔn)品。測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品濃度，換算成拷貝數(shù)為9.2×109copiesμL-1，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 反應(yīng)條件優(yōu)化 熒光定量PCR反應(yīng)體系共為25μL，含 12.5μL 2 ×PremixExTaq （ProbeqPCR），10μL RNase-free water，0.5μL Probe （10μM），0.5μL Primer F（10μM），0.5μL Primer R（10μM），質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品 1μL。反應(yīng)條件為：95℃5min；94℃15sec，55℃35sec，40 個(gè)循環(huán)。

2.3 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 用熒光PCR儀對(duì)9.2×101～9.2×109copiesμL-1的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖1和圖2可知，線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線建立成功，可用于臨床樣品的檢測(cè)。

圖1 PRV熒光定量PCR動(dòng)力學(xué)曲線

圖2 PRV熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 特異性試驗(yàn) 用所建立的熒光定量PCR方法對(duì)CSFV，PRRSV，PEDV，TGEV，RV，PPV和 PCV2等病毒的 cDNA或者DNA的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，說(shuō)明該方法與這些豬病病毒無(wú)交叉反應(yīng)（圖3），試驗(yàn)結(jié)果表明該方法具有良好的特異性。

2.5 敏感性試驗(yàn) 熒光定量PCR方法能檢出的DNA模板最低濃度為9.2×101copiesμL-（1圖1），而常規(guī)PCR能檢出的模板最低濃度為1.12×104copiesμL-（1圖4），試驗(yàn)結(jié)果表明所建立的熒光定量PCR方法的敏感性是常規(guī)PCR方法的100倍左右。

圖3 PRV熒光定量PCR特異性試驗(yàn)

圖4 PRV常規(guī)PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 用5種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于1.5%（表1），表明該方法具有良好的重復(fù)性與穩(wěn)定性。

2.7 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果 對(duì)本實(shí)驗(yàn)室收集的可疑PRV臨床樣品60份，分別進(jìn)行熒光定量PCR和常規(guī)PCR檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明，熒光定量PCR方法陽(yáng)性檢出率（58.3%）比常規(guī)PCR方法（46.7%）更高（表2）。對(duì)臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果表明熒光定量方法具有更高的敏感性，更適用于PRV野毒的臨床檢測(cè)，尤其是感染早期病毒含量較低時(shí)。

3 討論

PR是由PRV感染家畜或野生動(dòng)物引起的一種急性傳染病，臨床癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)熱、奇癢、呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。從2011年開始，由PRV變異株引起的PR疫情在我國(guó)多個(gè)省份相繼暴發(fā)，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此對(duì)PRV野毒感染尤其是病毒感染早期的及時(shí)、準(zhǔn)確診斷對(duì)PR的防控具有重要意義。

熒光定量PCR在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上引入了熒光探針，使得檢測(cè)方法具有更高的特異性和敏感性，并且PCR結(jié)束后可以直接觀察結(jié)果，無(wú)需進(jìn)一步凝膠電泳，同時(shí)也降低了開蓋點(diǎn)樣造成污染的可能性。熒光定量PCR整個(gè)過程操作簡(jiǎn)單，用時(shí)短，最快可以在2h內(nèi)得到檢測(cè)結(jié)果，已經(jīng)越來(lái)越多的被應(yīng)用于病原檢測(cè)領(lǐng)域。本研究根據(jù)GenBank中PRV gE基因序列設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針，建立了一種可區(qū)分PRV野毒株及基因缺失疫苗株的熒光定量PCR方法。通過對(duì)反應(yīng)條件的優(yōu)化，使得該方法在 9.2×101～9.2×109copiesμL-1模板范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，靈敏度達(dá)到9.2×101copiesμL-1，是常規(guī)PCR方法的100倍。與常規(guī)PCR方法相比，該方法對(duì)臨床樣品的檢出率更高。

表1 PRV熒光定量PCR重復(fù)性試驗(yàn)

表2 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

綜上所述，本研究所建立的區(qū)分PRV野毒株及基因缺失疫苗株的熒光定量PCR方法為PRV感染的早期診斷及其流行病學(xué)調(diào)查提供了快速、簡(jiǎn)便和可靠的技術(shù)工具。