顧慶新，王鐵林，過(guò)雨晴，蔣萌萌，馬 麗，曲思，宋博翠

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

過(guò)敏反應(yīng)是指機(jī)體在對(duì)某些抗原產(chǎn)生初次應(yīng)答后，再次接受相同抗原刺激時(shí)，機(jī)體產(chǎn)生一種以生理功能紊亂或組織細(xì)胞損傷為主要特征的特異性免疫應(yīng)答，臨床上主要表現(xiàn)為過(guò)敏性鼻炎、皮膚搔癢、蕁麻疹、支氣管哮喘等癥狀。由于其發(fā)病率較高，因此成為影響人類(lèi)健康的重要疾病之一。

在四種不同類(lèi)型的過(guò)敏反應(yīng)中最常見(jiàn)的為I型和IV型。其中，I型過(guò)敏反應(yīng)是免疫系統(tǒng)中最強(qiáng)烈的病理反應(yīng)之一，主要特征為機(jī)體針對(duì)抗原產(chǎn)生IgE抗體，Eos組織出現(xiàn)浸潤(rùn)現(xiàn)象，釋放炎性介質(zhì)。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，Eos在組織中出現(xiàn)浸潤(rùn)主要是通過(guò)趨化因子與其表面高表達(dá)的受體CCR3的結(jié)合實(shí)現(xiàn)的，能與受體CCR3結(jié)合的趨化因子種類(lèi)較多，但嗜酸粒細(xì)胞趨化因子（Eotaxin）是唯一能夠高選擇性與其特異性結(jié)合的配體，因此降低Eotaxin的表達(dá)是控制過(guò)敏性疾病進(jìn)程中的重要環(huán)節(jié)。

目前對(duì)治療過(guò)敏性疾病，采用藥物治療是一種有效的控制手段。但現(xiàn)有的治療藥物中存在開(kāi)發(fā)成本高、副作用大等問(wèn)題，而中藥因其價(jià)格較低、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。棉酚（Gossypol，GOS）是一種天然黃色多酚羥基雙萘醛類(lèi)化合物，主要存在于錦葵科植物棉花的根、莖和種子中，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)GOS具有抗炎、抗病毒、抗瘧、抗氧化及抗腫瘤等藥理作用，但其抗過(guò)敏的藥理作用還未見(jiàn)報(bào)道]。前期研究我們發(fā)現(xiàn)，棉酚具有潛在的抗過(guò)敏作用，本研究通過(guò)檢測(cè)GOS對(duì)Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)小鼠血清中,Eotaxin及其特異性受體CCR3水平的影響，初步探討GOS對(duì)I型過(guò)敏反應(yīng)的抑制作用，將其作為潛在的抗過(guò)敏藥物進(jìn)行研究與開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康Balb/c小鼠，雌雄各半8～10周齡，體重為18～20 g，均購(gòu)于吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，小鼠適應(yīng)1周后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

RPMI-1640培養(yǎng)液（美國(guó)Hyclone公司）；棉酚（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；環(huán)磷酰胺（美國(guó)Sigma公司）；mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Axygen公司）；瓊脂糖（Biowest公司）；OVA(美國(guó)Sigma公司)；Al(OH)3凝膠（河南樂(lè)水環(huán)?？萍加邢薰荆?；Eotaxin試劑盒（美國(guó)Biolegend公司）；Trizol試劑（賽默飛世爾科技）；胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；PBS緩沖液（江蘇綠葉生物科技公司）；其它化學(xué)試劑均為分析純，購(gòu)于吉林化學(xué)試劑廠。

1.2 方 法

1.2.1 Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)小鼠模型的建立

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取BALB/c小鼠，體重為18～20g，共60只。隨機(jī)分為6組，每組10只。分別為對(duì)照組、模型組、地塞米松組、棉酚低、中、高劑量組。取0.1mL含lmg/mL-1的OVA的免疫原液和0.05mg mL-1的Al(OH)3，對(duì)模型組和棉酚低、中、高劑量組小鼠進(jìn)行免疫。初次免疫方式是對(duì)每只小鼠背部?jī)蓚?cè)分多點(diǎn)進(jìn)行皮下注射，初次免疫后第3周，取0.1mL相同的免疫原對(duì)模型組和藥物組小鼠后腿肌肉部位進(jìn)行注射來(lái)加強(qiáng)免疫，對(duì)照組小鼠以同樣方法用生理鹽水進(jìn)行免疫。除對(duì)照組外，在建模第1天開(kāi)始小鼠腹腔注射給藥0.1mL。

1.2.2 血樣采集

小鼠加強(qiáng)免疫后7d，末次給藥1h后，通過(guò)摘取小鼠眼球方式進(jìn)行采血，血樣分別放入一個(gè)無(wú)菌離心管和一個(gè)含肝素的離心管中。其中，無(wú)菌離心管血樣于4℃冰箱中靜置過(guò)夜。第2天，將血樣放置離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速1000×g，離心20 min，使用移液器將分離后的血清移至新的離心管中待用。含肝素的離心管血樣使用淋巴細(xì)胞分離液分離出外周血單一核細(xì)胞（PBMC）后，將樣品放入Trizol試劑里，-80℃冰箱中保存待用。

1.2.3 ELISA法檢測(cè)血清中IgE、Eotaxin和CCR3的含量

將血清用樣品稀釋液稀釋20倍后，采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)炎性介質(zhì)IgE、Eotaxin和CCR3濃度。具體做法是將一抗包被于酶標(biāo)板4℃過(guò)夜后，第2d加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品37℃孵育2h讓其充分與一抗結(jié)合，加入生物素化的抗體形成免疫復(fù)合物，加入辣根過(guò)氧化物酶使其出現(xiàn)黃色，加終止液，待顏色變深，使用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)OD值，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求出標(biāo)本中待測(cè)蛋白的濃度。

1.2.4 RT-PCR法檢測(cè)外周血中Eotaxin和CCR3 mRNA表達(dá)

細(xì)胞總RNA提取采用Trizol試劑并嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。根據(jù)Genbank中嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子Eotaxin、CCR3的核苷酸序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物的序列見(jiàn)表1，由上海生物工程有限公司合成，實(shí)驗(yàn)樣品在1%的瓊脂糖凝膠中電泳后進(jìn)行凝膠成像分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用 SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）來(lái)表示，各組間比較采用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，p＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＜0.01具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 ELISA法檢測(cè)血清中IgE的含量

表1 PCR引物序列

通過(guò)ELISA試劑檢測(cè)血清中IgE含量的影響，結(jié)果如圖1所示，與空白對(duì)照組相比，OVA組血清中IgE含量較空白對(duì)照組高，說(shuō)明小鼠模型建立成功。使用棉酚作用后，Ⅰ型過(guò)敏小鼠血清中IgE的含量明顯下降，中、高劑量棉酚藥物組作用效果極其顯著（p＜0.01）。

2.2 ELISA法檢測(cè)血清中Eotaxin的含量

棉酚對(duì)血清中Eotaxin含量的影響結(jié)果如圖2所示。與空白對(duì)照組相比較，模型組小鼠血清中Eotaxin的濃度顯著提高。當(dāng)使用棉酚作用后，血清中Eotaxin的濃度均有所下降，其中，中、高劑量組作用極為顯著（p＜0.01），并且抑制Eotaxin的濃度與棉酚的濃度呈劑量依賴(lài)關(guān)系。

圖1 ELISA法檢測(cè)血清中IgE含量

圖2 ELISA法檢測(cè)血清中Eotaxin的含量

2.3 RT-PCR法檢測(cè)外周血中Eotaxin mRNA表達(dá)

通過(guò)RT-PCR檢測(cè)棉酚對(duì)外周血中Eotaxin mRNA表達(dá)的影響，結(jié)果如圖3所示。與空白對(duì)照組相比，模型組Eotaxin mRNA表達(dá)水平顯著升高。當(dāng)使用棉酚作用后，與模型組相比較，Eotaxin mRNA的表達(dá)水平均顯著下降（p＜0.01），其中，棉酚中、高劑量組的效果比環(huán)磷酰胺還好。

2.4 RT-PCR法檢測(cè)外周血中CCR3 mRNA表達(dá)

圖3 RT-PCR法檢測(cè)外周血中Eotaxin mRNA表達(dá)

圖4 RT-PCR法檢測(cè)外周血中CCR3 mRNA表達(dá)

棉酚對(duì)外周血中CCR3 mRNA表達(dá)的影響如圖4所示。與空白對(duì)照組比，OVA組CCR3 mRNA表達(dá)顯著提高。與OVA模型組相比，當(dāng)使用棉酚作用后，棉酚低劑量組的CCR3 mRNA的表達(dá)顯著下降（p＜0.05），而高、中劑量組作用極其顯著（p＜0.01）。

3 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)I型過(guò)敏小鼠背部?jī)蓚?cè)皮下多點(diǎn)注射的方式建立模型。其研究結(jié)果可以看出，空白對(duì)照組相比較，模型組血清中的的Eotaxin濃度、外周血中Eotaxin和CCR3 mRNA表達(dá)水平顯著升高。當(dāng)使用棉酚治療后發(fā)現(xiàn)，棉酚能夠降低通過(guò)降低Eotaxin和CCR3 mRNA的表達(dá)，其高劑量組作用最為顯著，其效果呈現(xiàn)劑量依賴(lài)關(guān)系。說(shuō)明棉酚能夠通過(guò)抑制Eotaxin和CCR3 mRNA的表達(dá)，減輕EOS的分化、活化、募集及局部浸潤(rùn)，從而控制癥狀，減輕過(guò)敏反應(yīng)發(fā)展，達(dá)到治療過(guò)敏性疾病的目的。