瞿夢潔，朱鋒，李慧冬,4，劉偉，朱端衛(wèi),2,*

1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院生態(tài)與環(huán)境工程研究室，武漢 430070 2. 生豬健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430070 3. 齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)，山東省分析測試中心，山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點實驗室，濟南 250014 4. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，濟南 250100

阿特拉津是種植玉米、高粱、甘蔗等農(nóng)作物過程中控制與去除闊葉雜草和禾本科雜草的除草劑[1-2]。在使用過阿特拉津地區(qū)的土壤、飲用水、表層水和地下水中都已檢測到該物質(zhì)的殘留。美國五大湖沉積物中檢出的阿特拉津含量范圍為0.01～1.7 ng·g-1[3]。在美國德克薩斯州、新墨西哥州和奧克拉荷馬州濕地以及意大利亞得里亞海北部沿岸瀉湖均有阿特拉津檢出[4-5]。我國松花江流域和長江流域阿特拉津的檢出率均為100%，長江中下游地區(qū)湖泊沉積物中阿特拉津含量為0.001～0.114 mg·kg-1[6-7]。阿特拉津會對水生生物造成一定的生態(tài)風(fēng)險，地表水的除草劑污染已成為水生生態(tài)系統(tǒng)植物種群退化和消亡的主要因素之一[8]。

植物對環(huán)境的耐受力與各種抗氧化酶和抗氧化劑關(guān)系緊密，各種逆境脅迫都可誘發(fā)植物細(xì)胞內(nèi)活性氧濃度的增加而導(dǎo)致氧化脅迫[9]。作為植物體內(nèi)一種重要的非酶抗氧化劑和氧化還原物質(zhì)，谷胱甘肽(還原型谷胱甘肽GSH或氧化型谷胱甘肽GSSG)是抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)能催化谷胱甘肽的共軛反應(yīng)。還原型GSH能有效去除由污染物產(chǎn)生的超氧自由基對植物細(xì)胞的傷害[10]。為了抵消對還原型GSH的消耗，谷胱甘肽還原酶(GR)能在NADPH的作用下，催化氧化型GSSG重新生成還原型GSH[11]。有研究表明，除草劑嗪草酮和丙草胺均能促進玉米植株的氧化應(yīng)激效應(yīng)[12]。目前，對除草劑誘導(dǎo)水生植物中氧化應(yīng)激效應(yīng)的生態(tài)毒性測試很少。因此，研究阿特拉津脅迫下沉水植物的氧化應(yīng)激效應(yīng)對植物的耐受性研究具有重要意義。

水體中的沉水植物既是沉積物及其上覆水水質(zhì)量的感受者，又是這一環(huán)境的改造者，植物對污染物的耐受性在維持淡水生態(tài)系統(tǒng)功能和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定中起著關(guān)鍵作用[13-14]。本實驗選擇沉水植物中的冬季優(yōu)勢種菹草(Potamogeton crispus)和夏季優(yōu)勢種穗花狐尾藻(Myriophyllum spicatum)為供試植物，探討阿特拉津?qū)Τ了参锷L的影響，并深入研究阿特拉津脅迫下沉水植物的谷胱甘肽代謝途徑對阿特拉津脅迫的應(yīng)答。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

供試沉積物：采自武漢市武昌湯遜湖(N30°25′57″, E114°22′34″)。沉積物采回后過10目篩，以去除各種雜質(zhì)，覆水靜置備用。沉積物的pH值為6.74，有機碳含量為1.83%，陽離子交換量為7.89 cmol·kg-1。

供試植物：作為長江中下游地區(qū)最常見的2種沉水植物，菹草和穗花狐尾藻分別屬于冬季優(yōu)勢種和夏季優(yōu)勢種[15-16]。本實驗沉水植物菹草和穗花狐尾藻采自武漢市植物園，選用生長狀態(tài)良好的成熟植株，采回后放入經(jīng)太陽暴曬過的水中備用。

實驗培養(yǎng)箱：用135 mm× 165 mm× 105 mm (內(nèi)徑×外徑×高)的PVC盆放置沉積物并種植植物，再將PVC盆置于680 mm× 520 mm× 390 mm (長×寬×高)的熟膠材質(zhì)水箱模擬天然水體環(huán)境。

阿特拉津：標(biāo)準(zhǔn)品購于德國Dr. Ehrenstorfer公司，純度≥ 99.5%；稱取100 mg阿特拉津，溶于1 L甲醇，配制成100 mg·L-1的阿特拉津-甲醇溶液。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：Triple TOFTM4600 LC/MS/MS (AB SCIEX, USA)。

色譜柱：AlltimaTMC18 (250 mm × 4.6 mm × 5 μm) (上海安譜科學(xué)儀器有限公司，上海)。

1.2 實驗設(shè)計

南湖沉積物中阿特拉津最高測定濃度為0.10 mg·kg-1[7]，為保證阿特拉津?qū)χ参锉３指邼舛鹊哪婢趁{迫，快速得到阿特拉津?qū)χ参锏亩纠眄憫?yīng)數(shù)據(jù)。將100 mg·L-1的阿特拉津-甲醇溶液分別取0、15、30和60 mL加入3 kg的沉積物中，機械混合，使沉積物中阿特拉津濃度分別達(dá)到0、0.5、1.0和2.0 mg·kg-1。分別取阿特拉津處理后沉積物1 kg加至PVC盆中，每個濃度處理設(shè)置3個重復(fù)。在沉積物中種植沉水植物，將種植植物后的PVC盆放置于水箱中，每個水箱中放置9盆相同阿特拉津濃度處理的植物，再以虹吸法加入暴曬后的自來水進行培養(yǎng)，使整個培養(yǎng)體系的水量達(dá)到120 L，并定期補充上覆水抵消蒸發(fā)。每盆種植的植物鮮重為12 g，各植株長度為20 cm。在培養(yǎng)的第30、60和90 天分別采集菹草和穗花狐尾藻鮮樣，每次取3盆植物。

1.3 測定方法

1.3.1 植物體中阿特拉津定量測定及其衍生物定性分析

前處理：將植物鮮樣冷凍干燥，稱取2.00 g植物干樣于50 mL離心管中，加入5 mL二氯甲烷振蕩30 min，以4 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液后過0.22 μm的有機濾膜，經(jīng)LC-18 (300 mg/3 mL, Supelco)固相萃取小柱純化氮吹后待進樣[7]。

樣品采用Triple TOFTM4600 LC/MS/MS (AB SCIEX, USA)質(zhì)譜儀測定，用Analysts軟件控制程序。注射5 μL樣品到C18 (AlltimaTM，250 mm × 4.6 mm, 5 μm)色譜柱中，保持35 ℃柱溫，流動相速度為0.3 mL·min-1。流動相組成為(A) 水 (100%)，(B) 甲醇 (100%)；樣品注入色譜柱之后，分析物用梯度洗脫程序洗脫：0 min (100% A), 0.5 min (90%A, 10%B), 6.0 min (10%A, 90%B)，8.2 min (90%A, 10%B)。其中氣體溫度設(shè)置為325 ℃，氣體流速為6 L·min-1，壓力為45 psi，鞘氣(高純液氮)加熱器為375 ℃，鞘氣氣流量為11 L·min-1，正極采用4 000 V毛細(xì)血管，用500 V電壓充電。阿特拉津的出峰保留時間為6.90 min，阿特拉津與谷胱甘肽脫去谷氨酸(Cys-β-Ala)的配合物的出峰保留時間為5.95 min。

1.3.2 植物體中谷胱甘肽、GR和GST的測定

在冰浴條件下，稱取0.5 g植物鮮樣于3.0 mL的緩沖液(1 mmol·L-1EDTA + 5%偏磷酸)中勻漿。在4 ℃條件下，將勻漿液以11 500 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清液測定谷胱甘肽含量[17]。GSSG和GSH含量參照 Griffith的方法測定[18]，GSH 含量為總谷胱甘肽(T-GSH)與 GSSG 的差值，單位為μmol·(g fw)-1。

稱取0.5 g植物鮮樣與50 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)、100 mmol·L-1氯化鉀溶液、1 mmol·L-1抗壞血酸溶液、5 mmol·L-1巰基乙醇和10%甘油在預(yù)先冷卻的研缽中混合勻漿。將勻漿液以11 500 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清液測定GR和GST活性[19]，酶活性單位為U·mg-1。以上指標(biāo)測定每處理重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理和分析

各項指標(biāo)測定每處理重復(fù)3次。數(shù)據(jù)分析與處理采用Mrcrosoft Excel處理，再用OriginPro 8.5和SPSS 18.0軟件進行繪圖及統(tǒng)計分析，所有結(jié)果均表示為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差(mean ± SD)，方差分析采用Tukey顯著性檢驗，當(dāng)不同處理間有顯著差異時，先標(biāo)注最小值，圖中誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果(Results)

2.1 沉水植物體內(nèi)阿特拉津濃度動態(tài)分析

植物根系能直接吸收污染物，污染物隨蒸騰流沿木質(zhì)部、韌皮部傳輸至植物莖和葉[20-21]。由圖1可知，當(dāng)沉積物中阿特拉津初始濃度為0.5、1.0和2.0 mg·kg-1時，在第30 天，菹草和穗花狐尾藻均能吸收一定量的阿特拉津。在培養(yǎng)達(dá)到60 d時，不同濃度處理的菹草體內(nèi)阿特拉津含量均在減少(P < 0.05)，但在高濃度下穗花狐尾藻體內(nèi)阿特拉津仍在增加。在培養(yǎng)達(dá)到90 d時，2種沉水植物體內(nèi)阿特拉津濃度基本為0。

2.2 沉水植物對阿特拉津污染脅迫的生物量響應(yīng)

當(dāng)沉積物中阿特拉津初始濃度為0 mg·kg-1和2.0 mg·kg-1時，考察阿特拉津?qū)Σ煌L時期植物生物量的影響。從表1可知，整個實驗周期中，沉水植物的長勢基本良好，鮮重皆呈上升趨勢。在培養(yǎng)的前60 d，未添加阿特拉津的沉水植物鮮重顯著高于2.0 mg·kg-1阿特拉津處理的沉水植物鮮重(P < 0.05)。在第90天，阿特拉津初始濃度為2.0 mg kg-1時，菹草和穗花狐尾藻的鮮重分別達(dá)到(45.51 ± 3.12) g和(57.32 ± 3.46) g，有無阿特拉津，培養(yǎng)的沉水植物鮮重?zé)o顯著差異(P > 0.05)。

2.3 沉水植物體內(nèi)總谷胱甘肽(T-GSH)含量、GSH/GSSG比值及其形態(tài)變化

阿特拉津脅迫下，植物體內(nèi)的T-GSH含量始終高于對照組，如圖2(A1-A2)所示，穗花狐尾藻體內(nèi)的T-GSH含量變化程度顯著大于菹草的T-GSH含量變化(P < 0.05)。在整個培養(yǎng)過程中，2 mg·kg-1阿特拉津脅迫下沉水植物體內(nèi)T-GSH含量顯著高于其他低濃度處理組。

植物體內(nèi)GSH/GSSG比值反映了植物對阿特拉津的氧化應(yīng)激效應(yīng)趨勢，如圖2(B1-B2)所示，植物體內(nèi)GSH/GSSG比值隨阿特拉津濃度升高基本呈下降趨勢。脅迫60 d后，各處理植物體內(nèi)GSH/GSSG比值有所回升，菹草的GSH/GSSG比值變化范圍為1.10 ± 0.23～2.43 ± 0.15，穗花狐尾藻的GSH/GSSG比值變化范圍為1.19 ± 0.12～2.43 ± 0.23，均低于空白對照的3.31。在脅迫90 d后，各處理植物體內(nèi)GSH/GSSG比值繼續(xù)回升，1.0 mg·kg-1與2.0 mg·kg-1阿特拉津處理下植物體內(nèi)的GSH/GSSG比值無顯著差異。與此同時，通過質(zhì)譜圖(圖3)對沉水植物體內(nèi)阿特拉津形態(tài)的定性分析得出，谷胱甘肽脫去谷氨酸(Cys-β-Ala)后能與阿特拉津耦合形成配合物(atrazine+(Cys-β-Ala)-HCl)。值得注意的是，在本實驗研究的沉水植物體內(nèi)，并未直接檢測到谷胱甘肽與阿特拉津配合物。

培養(yǎng)時間Incubation time0 d30 d60 d90 d菹草Potamogeton crispus0 mg·kg-112.31±3.12a24.23±3.13b36.36±5.06b49.39±5.06a2.0 mg·kg-112.09±2.39a15.48±1.46a21.09±2.13a45.51±3.12a穗花狐尾藻Myriophyllum spicatum0 mg·kg-112.13±2.12a29.44±3.16b45.39±4.14b63.34±5.13a2.0 mg·kg-112.39±2.03a16.54±2.46a26.36±2.16a57.32±3.46a

注：不同字母表示同列不同濃度處理間具有顯著差異(P < 0.05)。

Note：The different letters indicate significant difference between treatments in the same column (P < 0.05).

圖2 阿特拉津脅迫下菹草和穗花狐尾藻體內(nèi)T-GSH含量以及GSH/GSSG比值的變化注：圖A1和圖A2圖柱中不同小寫字母表示不同阿特拉津濃度處理間T-GSH差異顯著(P < 0.05)；圖B1和圖B2圖柱中不同小寫字母表示不同阿特拉津濃度處理間GSH/GSSG差異顯著(P < 0.05)。Fig. 2 Effects of different levels of atrazine on T-GSH content and GSH/GSSG ratio of Potamogeton crispus and Myriophyllum spicatumNote: in Fig. A1 and A2 different lowercase letters represent significant differences among T-GSH contents in different atrazine treatments (P < 0.05); in Fig. B1 and B2 different lowercase letters represent significant differences among GSH/GSSG in different atrazine treatments (P < 0.05).

圖3 阿特拉津與Cys-β-Ala配合物的一級與二級質(zhì)譜圖Fig. 3 MS and MS2 spectra of atrazine+(Cys-β-Ala)-HCl in plants from LC/MS/MS analysis

2.4 沉水植物體內(nèi)的GR和GST活性動態(tài)變化

植物體內(nèi)谷胱甘肽的形成主要受GR和GST活性的影響。從圖4可知，阿特拉津的添加增加了GR在植物體內(nèi)的活性。培養(yǎng)第30天時，在1.0和2.0 mg·kg-1阿特拉津處理下，菹草體內(nèi)GR活性分別達(dá)到最大的(1.00 ± 0.05)和(1.14 ± 0.05) U·mg-1，穗花狐尾藻體內(nèi)GR活性分別達(dá)到最大的(1.00 ± 0.03)和(1.43 ± 0.03) U·mg-1。不同于1.0和2.0 mg·kg-1阿特拉津處理下的GR活性變化，在60 d時，0.5 mg·kg-1阿特拉津處理下菹草和穗花狐尾藻體內(nèi)的GR活性依舊保持增加，直到達(dá)到(0.86 ± 0.09)和(0.71 ± 0.08) U·mg-1的最大值。在90 d時，所有植株體內(nèi)GR活性均達(dá)到整個培養(yǎng)階段的最低值。

如圖5所示，與GR活性變化類似，阿特拉津加強了GST在植物體內(nèi)的活性，未添加阿特拉津的空白組GST活性保持(3.81 ± 0.65) U·mg-1不變。培養(yǎng)第30天時，在0.5、1.0和2.0 mg·kg-1阿特拉津處理下，菹草體內(nèi)GST活性分別達(dá)到最大的(7.62 ± 0.99)、(15.24 ± 1.26)和(26.67 ± 2.35) U·mg-1，穗花狐尾藻體內(nèi)GST活性達(dá)到最大的(7.62 ± 0.74)、(11.43 ± 0.86)和(22.86 ± 2.23) U·mg-1。在培養(yǎng)30～90 d時，草和穗花狐尾藻菹體內(nèi)的GST活性逐漸降低。

圖4 阿特拉津脅迫下菹草和穗花狐尾藻體內(nèi)GR活性的變化注：圖中不同小寫字母分別表示脅迫0、30、60和90 d時不同阿特拉津濃度處理間差異顯著(P< 0.05)。Fig. 4 Effects of different levels of atrazine on GR value of Potamogeton crispus and Myriophyllum spicatumNote: Different lowercase letters represent significant differences among different atrazine treatments on days 0, 30, 60 and 90, respectively (P < 0.05).

圖5 阿特拉津脅迫下菹草和穗花狐尾藻體內(nèi)GST活性的變化注：圖中不同小寫字母分別表示脅迫0、30、60和90 d時不同阿特拉津濃度處理間差異顯著(P<0.05)。Fig. 5 Effects of different levels of atrazine on GST value of Potamogeton crispus and Myriophyllum spicatumNote: Different lowercase letters represent significant differences among different atrazine treatments on days 0, 30, 60 and 90, respectively (P < 0.05).

在第90天時，除2 mg·kg-1阿特拉津處理下穗花狐尾藻GST活性為(7.62 ± 0.99) U·mg-1，其他所有處理組的植物GST活性均為3.81 U·mg-1。

3 討論(Discussion)

阿特拉津一旦從水相中進入沉積物，則很難解吸出來，使得水相中的阿特拉津濃度遠(yuǎn)低于沉積物中阿特拉津濃度[7]。因此，本文對水相中阿特拉津含量不予討論。在培養(yǎng)的0～60 d內(nèi)，植物體內(nèi)的阿特拉津保持一定濃度，表明此階段的阿特拉津?qū)χ参锏拿{迫作用較強，且沉積物阿特拉津初始濃度越高，植物體內(nèi)阿特拉津濃度越高。在培養(yǎng)60～90 d時，不同濃度處理下植物體內(nèi)阿特拉津迅速減少，因而阿特拉津的脅迫作用會相應(yīng)減弱。有研究表明，植物體內(nèi)除草劑濃度與植物生物量、GSH/GSSG比例和GST含量密切相關(guān)[12]。

菖蒲能在20 mg·L-1阿特拉津濃度下繼續(xù)生長[22]。與此同時，Wang等[23]曾經(jīng)報道菖蒲、千屈菜和水蔥能在阿特拉津濃度< 8 mg·L-1的培養(yǎng)液中存活，隨著時間的增加，阿特拉津?qū)χ参锏呢?fù)面影響會減弱。與報道的挺水植物類似，在前60 d內(nèi)，本實驗中添加的阿特拉津?qū)?種沉水植物的生長均產(chǎn)生顯著抑制作用，植物生物量的減少可能是由某些代謝過程的變化引起的[24]。在這一時期，阿特拉津可能誘導(dǎo)了植物體內(nèi)的抗氧化物質(zhì)的活性，從而在一定程度上保護了菹草和穗花狐尾藻[25]。在培養(yǎng)實驗的末期，這種抑制作用逐漸減弱，植物重量有所回升，這與植物體內(nèi)阿特拉津含量變化密切相關(guān)。

在培養(yǎng)第30 天時，菹草和穗花狐尾藻體內(nèi)GSH的下降表明植物受到了阿特拉津及活性氧的毒害作用。作為大多數(shù)好氧生物抗氧化效應(yīng)的關(guān)鍵組分，GSH的消耗會誘導(dǎo)植物對外源毒害出現(xiàn)更強的氧化應(yīng)激效應(yīng)[26]。隨著培養(yǎng)時間增加，植物對阿特拉津的降解程度加大(2.1所示)，GSH/GSSG比值回升，GSH含量增加，氧化應(yīng)激效應(yīng)減弱。除了與活性氧反應(yīng)生成GSSG來降低阿特拉津的氧化毒性，GSH還可與阿特拉津耦合形成新的化合物。不同于水稻中GSH直接與阿特拉津耦合，菹草和穗花狐尾藻體內(nèi)的谷胱甘肽脫去谷氨酸(Cys-β-Ala)后才能與阿特拉津耦合形成配合物(atrazine+(Cys-β-Ala)-HCl)，這一過程可能降低了阿特拉津?qū)χ参锏亩拘訹27]。

Alla和Hassan(2007)[26]認(rèn)為，高劑量異丙隆會誘導(dǎo)氧化應(yīng)激效應(yīng)，并對GR活性產(chǎn)生一定的抑制作用。不同的是，本研究中GR活性隨著GSH的下降而增加，我們可以理解為當(dāng)植物體內(nèi)GSH下降時，會誘導(dǎo)GR活性增加，雖然除草劑的存在會抑制GR的活性，但是這種抑制作用顯著弱于誘導(dǎo)作用。有研究表明，植物對除草劑的抗性取決于GST催化作用下GSH的結(jié)合反應(yīng)[28]，在阿特拉津存在及GSSH含量增加的條件下，菹草和穗花狐尾藻體內(nèi)的 GST活性得到了增加，加強了植物對除草劑的防御能力。菹草和穗花狐尾藻對阿特拉津的耐受性差異主要與GSH和GSH相關(guān)酶的差異誘導(dǎo)有關(guān)[29]。