方政，董玉瑛，趙晶晶，鄒學(xué)軍

大連民族大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，大連 116605

近些年，隨著不同水源中陸續(xù)檢測(cè)出醫(yī)藥品活性成分相關(guān)的微量有機(jī)污染物，其引發(fā)的對(duì)人類生存及生態(tài)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)問題已受到國(guó)內(nèi)外環(huán)境學(xué)者及社會(huì)大眾的廣泛關(guān)注[1-2]。布洛芬作為苯丙酸類新一代非甾體類消炎鎮(zhèn)痛藥物的典型代表，由于毒性低、療效好及副作用小而得到世界衛(wèi)生組織、美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)唯一共同推薦的兒童退燒藥得到廣泛應(yīng)用[3-5]；阿奇霉素屬半合成的十五元環(huán)內(nèi)酯類抗生素，因其引起不良反應(yīng)的發(fā)生率小，受性良好，所以在治療人類和動(dòng)物感染方面具有較一般抗生素類更好的療效[6-8]；而三氯生(TCS)是一種常用的高效抗菌劑，醫(yī)藥品中常見為三氯生乳膏，因其對(duì)多種細(xì)菌、真菌具有殺滅和抑制作用，能夠作為醫(yī)藥品與個(gè)人護(hù)理品的殺菌、防腐劑，進(jìn)而在環(huán)境中存在較為普遍[9]。這些常見醫(yī)藥中存在的活性成分釋放到環(huán)境中能夠?qū)θ梭w健康及生態(tài)環(huán)境造成不同程度的威脅，同時(shí)這類污染物往往在全球范圍內(nèi)普遍存在，在環(huán)境中具有較高的穩(wěn)定性，難以降解且易在生態(tài)系統(tǒng)中富集[10-11]，對(duì)環(huán)境中包括人類在內(nèi)的各類生物產(chǎn)生的危害不容忽視。

當(dāng)環(huán)境通過自凈能力卻不能完全去除殘留在環(huán)境中的新型污染物，如抗生素等藥品活性成分時(shí)，還可能出現(xiàn)環(huán)境中的耐藥菌株大量增加的生態(tài)現(xiàn)象，增大了耐藥菌對(duì)人與其他生物感染的風(fēng)險(xiǎn)。現(xiàn)實(shí)生活中，以抗生素為代表的常見醫(yī)藥品往往都以混合物的形式存在[12]，本研究中選擇的3種常見醫(yī)藥品在生活中作為解熱鎮(zhèn)痛類藥品、抗感染類藥品及殺菌類藥品使用，在生活中，如人類及動(dòng)物遇到發(fā)熱及敏感細(xì)菌急性皮炎等情況時(shí)會(huì)相互搭配使用。方淑霞等[13]的研究表明，環(huán)境中抗生素等醫(yī)藥品混合物間總表現(xiàn)出與單一化合物不同的毒性作用?，F(xiàn)階段已有關(guān)于這3種醫(yī)藥品混合物對(duì)環(huán)境影響方面的研究，武小燕[14]在關(guān)于布洛芬、三氯生對(duì)黃顙魚酶及抗氧化酶系的毒性效應(yīng)研究中得到結(jié)論，混合暴露的結(jié)果與布洛芬和三氯生單獨(dú)對(duì)黃顙魚進(jìn)行暴露的結(jié)果不同。李義剛[15]在三氯生、布洛芬和氯化鎘對(duì)羊角月牙藻的毒性效應(yīng)研究中，對(duì)布洛芬和三氯生對(duì)羊角月牙藻的毒性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，三氯生對(duì)羊角月牙藻屬于高毒物質(zhì)，布洛芬對(duì)羊角月牙藻體內(nèi)抗氧化酶系中CAT和MDA也有較大影響，氯化鎘和三氯生對(duì)羊角月牙藻聯(lián)合毒性表現(xiàn)為拮抗作用，氯化鎘和布洛芬對(duì)羊角月牙藻聯(lián)合毒性表現(xiàn)為協(xié)同作用。李義剛[15]的研究中并未對(duì)三氯生和布洛芬的聯(lián)合作用進(jìn)行分析。關(guān)于布洛芬、阿奇霉素和三氯生這3種藥品在環(huán)境中的聯(lián)合毒性作用研究目前還比較少見，因此，全面和及時(shí)了解這3種常見醫(yī)藥品混合物在環(huán)境中生態(tài)毒性效應(yīng)已迫在眉睫。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合發(fā)光菌具有快速、靈敏、操作簡(jiǎn)單、應(yīng)用范圍廣泛等優(yōu)點(diǎn)，將其作為受試生物，研究布洛芬、阿奇霉素和三氯生3種醫(yī)藥品在環(huán)境中的單一及聯(lián)合作用，為評(píng)價(jià)該類新型污染物對(duì)環(huán)境及生物的影響提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

恒溫振蕩器；恒溫培養(yǎng)箱；恒溫磁力攪拌器；高壓蒸氣滅菌鍋；潔凈工作臺(tái)；BS214D型電子天平；DXY22型生物毒性測(cè)試儀；量程不同的精密移液器等。

1.2 試劑材料

1.2.1 主要試劑

布洛芬緩釋膠囊和阿奇霉素分散片購(gòu)于長(zhǎng)春海外制藥集團(tuán)有限公司和東北制藥集團(tuán)沈陽(yáng)第一制藥有限公司，采用校正后的有效成分含量進(jìn)行配制。三氯生和氯化鈉等試劑均為分析純。

1.2.2 菌種的培養(yǎng)

發(fā)光菌凍干粉制劑的復(fù)蘇：無菌條件下，取已滅菌的3% NaCl溶液1 mL加入于明亮發(fā)光桿菌(Photobacterium phosphoreum)的凍干粉制劑中，均勻混合，常溫下放置2 min后，明亮發(fā)光菌即為復(fù)蘇。

斜面菌種的培養(yǎng)：明亮發(fā)光菌復(fù)蘇完成后，立刻將已復(fù)蘇的明亮發(fā)光菌用已滅菌的接種棒轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基中，20 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)接第二代，并將第二代置于20 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h后，繼續(xù)轉(zhuǎn)接第三代，并于20 ℃下培養(yǎng)24 h后放置于冰箱中備用保存，以上操作均需在無菌條件下進(jìn)行。

搖瓶菌液的培養(yǎng)：將上述制得的明亮發(fā)光菌第三代斜面菌菌種轉(zhuǎn)接到含有100 mL培養(yǎng)液的250 mL錐形瓶中，于20 ℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期備用。

工作菌液的制備：吸取一定量的搖瓶菌液于3% NaCl溶液中，充分?jǐn)嚢?，發(fā)光強(qiáng)度控制在300～900為宜。

1.3 急性毒性EC50的測(cè)定

發(fā)光細(xì)菌急性毒性測(cè)試經(jīng)預(yù)試驗(yàn)、單一毒性分析和聯(lián)合毒性分析等步驟實(shí)施。

1.3.1 預(yù)實(shí)驗(yàn)

對(duì)選定的試劑設(shè)置濃度梯度進(jìn)行試驗(yàn)，觀察15 min時(shí)待測(cè)化合物對(duì)明亮發(fā)光菌的發(fā)光抑制率，并確定適宜的毒性實(shí)驗(yàn)暴露濃度范圍。

1.3.2 單一毒性EC50的測(cè)定

基于預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，進(jìn)行單一實(shí)驗(yàn)，將待測(cè)化合物用3% NaCl溶液稀釋配制為13個(gè)對(duì)數(shù)等間距分布的濃度，吸取不同梯度的樣品溶液2 mL于具塞磨口比色管中，以2 mL 3%NaCl 溶液作空白對(duì)照，再將0.5 mL 的工作菌液加入測(cè)試管中，加塞上下振蕩均勻，去塞，精確計(jì)時(shí)暴露15 min時(shí)測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度。每組濃度梯度做3個(gè)平行樣，確保毒性分析結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差低于10%。

1.3.3 聯(lián)合毒性EC50的測(cè)定

根據(jù)單一毒性測(cè)試的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，繪制毒性作用的效應(yīng)-劑量曲線，以獲得3種醫(yī)藥品對(duì)發(fā)光菌的單一毒性EC50；并將待測(cè)物布洛芬、阿奇霉素、三氯生根據(jù)單一毒性測(cè)得的EC40、EC45、EC50、EC55、EC60，按等毒性比例配制二元及多元混合體系，以3%NaCl為空白對(duì)照，每組濃度設(shè)置3個(gè)平行，確保3組平行實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差低于10%，測(cè)定二元及三元混合體系醫(yī)藥品對(duì)發(fā)光菌的聯(lián)合毒性作用的EC50。

1.4 數(shù)據(jù)處理

由于3種醫(yī)藥品濃度與對(duì)應(yīng)的發(fā)光抑制率在EC50附近呈良好的線性分布關(guān)系，進(jìn)而采用Excel繪圖，測(cè)得樣品溶液的發(fā)光強(qiáng)度與空白對(duì)照的發(fā)光強(qiáng)度之比即為抑制率，其表達(dá)式為：

以抑制率對(duì)濃度作圖，求得抑制率為50%時(shí)的化合物溶液濃度，即為EC50。化合物濃度和死亡率之間的相關(guān)系數(shù)r，經(jīng)顯著水平檢驗(yàn)，置信區(qū)間范圍大于90%。

1.5 聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)方法

多元混合體系下的污染物對(duì)生物體的聯(lián)合毒性作用類型包括獨(dú)立作用、協(xié)同作用、相加作用和拮抗作用4種，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用相加指數(shù)法(AI)、毒性單位法(TU)、混合毒性指數(shù)法(MTI)3種評(píng)價(jià)方法對(duì)3種醫(yī)藥品二元及三元混合體系的作用類型進(jìn)行定量判別和分析[16]，聯(lián)合毒性作用類型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 單一毒性作用測(cè)試分析

3種醫(yī)藥品對(duì)發(fā)光菌均呈現(xiàn)出不同程度的抑制作用，其對(duì)發(fā)光菌的半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)分別為：36.5×10-5、30.26×10-5和0.0155×10-5mol·L-1；其毒性強(qiáng)弱作用為：三氯生>阿奇霉素>布洛芬，即三氯生的毒性作用最強(qiáng)。圖1為3種醫(yī)藥品的分子結(jié)構(gòu)式，順序依次為布洛芬、阿奇霉素、三氯生。從結(jié)構(gòu)圖中可以看出，3種醫(yī)藥品的取代基為-OH、-Cl。翟麗華[17]選取17個(gè)部分取代苯化合物，研究其對(duì)發(fā)光菌的急性毒性，得取代基對(duì)發(fā)光菌的毒性貢獻(xiàn)大小順序?yàn)椋?NO2>-Cl>-CH3>-NH2>-OH。翟麗華[17]的實(shí)驗(yàn)結(jié)論對(duì)本研究結(jié)果具有借鑒意義。因此推斷3種不同醫(yī)藥品對(duì)發(fā)光菌的抑制效應(yīng)的差異，是由于不同取代基影響作用效應(yīng)程度不同導(dǎo)致的。對(duì)于這種結(jié)論仍需進(jìn)一步對(duì)分子相互作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。

圖1 3種醫(yī)藥品結(jié)構(gòu)式Fig. 1 The structure of three kinds of pharmaceuticals

表1 不同評(píng)價(jià)指數(shù)的聯(lián)合作用類型判斷標(biāo)準(zhǔn)Table 1 The joint toxicity types and standards of different evaluating methods

2.2 二元混合體系的聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)

綜合分析二元混合體系對(duì)發(fā)光菌的聯(lián)合毒性作用(見表3)，我們可以看出，等毒性比例混合時(shí)，3種醫(yī)藥品二元聯(lián)合毒性的EC50值明顯大于單一毒性的EC50，表明二元混合體系的毒性低于單一毒性作用。同時(shí)，由于阿奇霉素+布洛芬，三氯生+布洛芬，三氯生+阿奇霉素這3組二元混合體系的M均大于M0，AI和MTI均小于0，因此這3組混合體系的作用類型表現(xiàn)為拮抗作用。由于AI越接近于0，其作用類型越趨于相加作用，而MTI越接近于0，其作用類型越趨于獨(dú)立作用，因此根據(jù)3組二元混合體系的AI及MTI的不同，可判斷其拮抗作用強(qiáng)弱的差異，進(jìn)而判定3種醫(yī)藥品二元混合體系對(duì)發(fā)光菌的作用強(qiáng)度為：三氯生+阿奇霉素>三氯生+布洛芬>阿奇霉素+布洛芬。

2.3 三元混合體系的聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)

由于二元混合體系聯(lián)合毒性表現(xiàn)為拮抗作用，因此猜測(cè)3種醫(yī)藥品分子間的相互作用可導(dǎo)致體系聯(lián)合毒性降低，多個(gè)二元拮抗體系累加，各分子間相互作用增強(qiáng)可導(dǎo)致多元混合體系繼續(xù)呈現(xiàn)拮抗作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出三元混合體系聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)參數(shù)和作用類型見表4，等毒性比例混合的三元混合體系的聯(lián)合毒性EC50明顯大于二元和單一毒性作用的EC50值，表明三元混合體系的毒性更弱。由于等毒性比三元混合體系的M均大于M0，AI小于0，MTI小于0，因此三元混合體系的聯(lián)合作用類型為拮抗作用。本實(shí)驗(yàn)獲得聯(lián)合毒性類型為拮抗作用，與前人研究結(jié)果相一致。叢永平等[18]研究發(fā)現(xiàn)四環(huán)素類抗生素和氯霉素類抗生素對(duì)發(fā)光菌的聯(lián)合急性毒性也表現(xiàn)出拮抗作用。

表2 3種醫(yī)藥品單獨(dú)作用時(shí)的EC50Table 2 EC50 values when three kinds of drugs act alone

表3 二元混合體系的EC50值和聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)參數(shù)及作用類型Table 3 EC50 values, and joint toxicity evaluation parameters and action types of binary mixtures

表4 三元混合體系的EC50值和聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)參數(shù)和作用類型Table 4 EC50 values, and joint toxicity evaluation parameters and action types of ternary mixtures

2.4 毒性作用機(jī)制初步探討及其類型評(píng)價(jià)

綜合分析二元、三元混合體系聯(lián)合毒性，均為拮抗效應(yīng)，因此猜測(cè)3種醫(yī)藥品的活性成分能夠相互作用并導(dǎo)致聯(lián)合毒性降低，各活性成分間相互作用增強(qiáng)導(dǎo)致多元混合體系呈現(xiàn)拮抗。而我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也與假設(shè)相符，任皓等[19]對(duì)鹽酸吉他霉素與金霉素、鹽霉素、黃霉素對(duì)發(fā)光細(xì)菌聯(lián)合毒性作用實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明：在多個(gè)混合體中，拮抗作用表現(xiàn)較強(qiáng)的分子混合體系起主導(dǎo)作用。方章順等[20]研究典型抗生素與群體感應(yīng)抑制劑對(duì)費(fèi)氏弧菌的三元慢性聯(lián)合毒性，證明了兩元混合體系的拮抗作用是三元體系拮抗作用的根本原因。由此可見，污染物在環(huán)境中經(jīng)過各途徑混合后，其相互作用可能導(dǎo)致毒性減弱。對(duì)于呈現(xiàn)的這種聯(lián)合作用效應(yīng)，也可用發(fā)光菌發(fā)光原理進(jìn)行初步的聯(lián)合毒性分析，發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光機(jī)制基本都存在細(xì)菌熒光素酶(LE)、還原態(tài)黃素單核苷酸(FMNH2)、氧氣(O2)、長(zhǎng)鏈脂肪醛(RCHO)的參與[19, 21-22]。其發(fā)光反應(yīng)方程式如下：

在這一反應(yīng)過程中，黃素單核苷酸作為重要的輔酶，其氧化形式(FMN)與還原形式(FMNH2)之間的轉(zhuǎn)化在整個(gè)反應(yīng)過程中起到了傳遞氫的作用。實(shí)驗(yàn)中3種常見醫(yī)藥品分子中均含有羥基(-OH)易與黃素單核苷酸結(jié)合形成氫鍵，阻礙發(fā)光反應(yīng)中FMNH2在氧化和還原作用之間氫的傳遞，干擾正常的發(fā)光反應(yīng)進(jìn)程，抑制發(fā)光菌發(fā)光。與此同時(shí)，由于阿奇霉素和布洛芬的分子中均含有N元素，N元素作為一種營(yíng)養(yǎng)因子，在一定程度上能夠?qū)Πl(fā)光反應(yīng)過程起到促進(jìn)作用[21, 23-24]，降低了其他化合物對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的抑制效果，進(jìn)而呈現(xiàn)出了拮抗這種作用類型。如想更具體地對(duì)引起拮抗作用的原因進(jìn)行分析，還需進(jìn)一步對(duì)測(cè)試污染物聯(lián)合作用的機(jī)制以及發(fā)光菌的生理生化反應(yīng)等進(jìn)行深入探索。就目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果而言，我們可以推斷出這3種醫(yī)藥品能夠?qū)λw環(huán)境及水生生物，例如微生物、浮游生物、藻類、魚類等有同樣的毒性作用，而藥物毒性在水生生物體內(nèi)富集，一旦進(jìn)入水源并通過食物鏈逐級(jí)遞增進(jìn)入人體，毒性在人體內(nèi)部將被放大，所以無論是現(xiàn)在或是未來，醫(yī)藥品這類新興污染物都將會(huì)對(duì)環(huán)境及生物造成很大的威脅，對(duì)于此類污染物的聯(lián)合作用研究迫在眉睫。