趙晶晶，董玉瑛，方政，鄒學軍

大連民族大學 環(huán)境與資源學院，大連116605

醫(yī)藥品、個人護理品以及內(nèi)分泌干擾物等新型有機污染物(emerging organic contaminants，EOCs)多為具有生物活性物質(zhì)，其進入水體環(huán)境，可誘發(fā)水生生物發(fā)生不同應(yīng)激變化，對生態(tài)環(huán)境和生物健康的危害風險較大[1]。其中布洛芬(IBP，C13H18O2)是具有抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱作用的常用非甾體抗炎藥，使用劑量較大，達1 200 mg·d-1[2]，同時已有研究在不同來源水體中檢測到其存在[3-5]。各類有機物需進入城市污水廠經(jīng)生化處理達標后排放，其過程中穩(wěn)定的污泥處理效果是保障出水水質(zhì)達標的重要基礎(chǔ)，而污水處理廠污泥中存在著數(shù)量眾多、遺傳與代謝方式多樣的微生物，它們在污染物的去除中發(fā)揮著關(guān)鍵驅(qū)動作用。但微生物無法完全去除大部分新型有機污染物，如國內(nèi)污水處理廠布洛芬的去除率約為41.6%[6-7]，去除率低。并且新型有機污染物多具有生物毒性[8-9]，會影響水處理效果。已有研究發(fā)現(xiàn)，污水中的有毒物質(zhì)超過一定濃度時，會影響和干擾微生物的正常代謝，進一步影響污水生物處理效果[10]。

不同酶的功能有特異性，是污泥活性的直接反應(yīng)?；钚晕勰嗌锎x功能與一系列酶活性密切相關(guān)[11]。這些酶擔負著凈化污水的使命，同時其功能也會受到污水中具有生物活性EOCs存在的影響[12]。因此，測定EOCs對污泥微生物群落的影響、篩選影響污泥生態(tài)功能的敏感指標，可及時預(yù)警污水處理系統(tǒng)污泥活性出現(xiàn)異動的情況。

因為如布洛芬的新型有機污染物使用量大、去除率低，且藥品的存在會影響活性污泥微生物的活性，而傳統(tǒng)的監(jiān)測指標存在不足。所以需要篩選敏感污泥活性指標，以有效預(yù)測風險。研究通過將活性污泥暴露于布洛芬存在的條件下進行相關(guān)指標分析，主要選擇活性污泥中脲酶活性、轉(zhuǎn)化酶活性為主要分析指標。對各指標進行對比分析，為篩選敏感污泥活性指標、有效預(yù)測可能出現(xiàn)的環(huán)境風險提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與材料

UV-1000分光光度計(上海，美普達儀器有限公司)；THZ-B臺式恒溫振蕩器(常州，諾基儀器有限公司)；PHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海，一恒科技有限公司)；DHG-9246A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海，精宏實驗設(shè)備有限公司)。

實驗用布洛芬購自海外制藥有限公司。其他試劑均為分析純。實驗中所用活性污泥均取自大連某污水處理廠的曝氣池，其基本理化指標：混合液懸浮固體(MLSS)1 609 mg·L-1；揮發(fā)性懸浮物(VSS)0.7 mg·L-1；污泥容積指數(shù)(SVI)80～120 mL·g-1；濁度3 500～3 700 mg·L-1，耗氧速率(OUR)3 mg·g-1·h-1。污泥在進行后續(xù)實驗前進行充分的曝氣培養(yǎng)。

1.2 生化指標分析方法

1.2.1 脲酶活性分析方法

脲酶的活性測定應(yīng)用苯酚鈉比色法[13]。通過多組空白試驗，確定活性污泥脲酶活性的穩(wěn)定時間段，根據(jù)實驗時間要求控制污泥與藥品的暴露時間。將污泥與0～40 μg·L-1的布洛芬等體積混合暴露。隨后將污泥懸濁液與甲苯充分混合，加入10%的尿素溶液和檸檬酸緩沖溶液，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取濾液加入苯酚鈉和次氯酸鈉，混勻后靜置。溶液在稀釋后于578 nm測吸光度。每組設(shè)置2個平行樣。同時設(shè)置無土對照與無基質(zhì)對照，用以檢驗試劑純度和基質(zhì)自身分解。無土對照即不加土樣，其他操作與樣品實驗相同。無基質(zhì)對照即以等體積的水代替基質(zhì)，其他操作與樣品實驗相同。

1.2.2 轉(zhuǎn)化酶活性分析方法

轉(zhuǎn)化酶的活性測定應(yīng)用3,5-二硝基水楊酸法[13]。通過多組空白試驗，確定活性污泥轉(zhuǎn)化酶活性的穩(wěn)定時間段，根據(jù)實驗時間要求控制污泥與藥品的暴露時間。將污泥與0～40 μg·L-1的布洛芬等體積混合，暴露15 h。隨后將污泥懸濁液中加入磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液、10%的蔗糖溶液和甲苯溶液，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取濾液加入3,5-二硝基水楊酸溶液，沸水浴加熱，然后冷卻，稀釋后于578 nm測吸光度。每組設(shè)置2個平行樣。同時設(shè)置無土對照與無基質(zhì)對照，用以檢驗試劑純度和基質(zhì)自身分解。無土對照即不加土樣，其他操作與樣品實驗相同。無基質(zhì)對照即以等體積的水代替基質(zhì)，其他操作與樣品實驗相同。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

1.3.1 酶活性表征

活性污泥中酶活性的計算方法參關(guān)松萌[13]的酶活性計算方法。酶活性以24 h后1 g烘干污泥對應(yīng)生成產(chǎn)物的質(zhì)量表示。

脲酶活性以24 h后1 g烘干污泥對應(yīng)NH3-N生成量的毫克數(shù)表示：

(1)

式中：a樣品為樣品吸光度值對應(yīng)標準曲線求得的NH3-N毫克數(shù)；a無污泥為無污泥對照吸光度值對應(yīng)標準曲線求得的NH3-N毫克數(shù)；a無基質(zhì)為無基質(zhì)對照吸光度值對應(yīng)標準曲線求得的NH3-N毫克數(shù)；V為顯色液體積(mL)；n為分取倍數(shù)，即浸出液體積/吸取濾液體積；m為烘干污泥的質(zhì)量(g)。

轉(zhuǎn)化酶活性以24 h后1 g烘干污泥對應(yīng)葡萄糖生成量的毫克數(shù)表示：

(2)

a樣品為樣品吸光度值對應(yīng)標準曲線求得的葡萄糖毫克數(shù)；a無污泥為無污泥對照吸光度值對應(yīng)標準曲線求得的葡萄糖毫克數(shù)；a無基質(zhì)為無基質(zhì)對照吸光度值對應(yīng)標準曲線求得的葡萄糖毫克數(shù)；V為顯色液體積(mL)；n為分取倍數(shù)，即浸出液體積/吸取濾液體積；m為烘干污泥的質(zhì)量(g)。

圖1 酶活性與暴露時間關(guān)系Fig. 1 Relationship between enzyme activity and exposure time

圖2 不同濃度布洛芬對污泥脲酶活性的影響Fig. 2 Effect of different concentrations of ibuprofen on urease activity

1.3.2 酶活性變化率分析

以布洛芬暴露濃度與酶活性的動態(tài)變化率、總變化率的劑量-效應(yīng)關(guān)系表示酶活性在布洛芬暴露下的變化情況。

(3)

式中：R為酶活性變化率，Rn為本測定點酶活性值，Rn-1為上一測定點酶活性值，R0為布洛芬暴露濃度為零時的酶活性值。

酶活性動態(tài)變化率表達的是酶活性在本測定點與上一測定點區(qū)間內(nèi)的變化情況，是對酶活性變化的動態(tài)分析，強調(diào)相鄰測定點區(qū)間內(nèi)的變化情況。

(4)

式中：I為酶活性抑制率，I0為布洛芬暴露濃度為零時的酶活性值，In為本測定點酶活性值。

酶活性總變化率表達的是酶活性在某一濃度點與零濃度點相比的變化程度，是對酶活性總體變化情況的分析，強調(diào)總體趨勢。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 污泥酶活性穩(wěn)定時間

通過多組空白試驗數(shù)據(jù)，確定活性污泥酶活性的穩(wěn)定暴露時間，發(fā)現(xiàn)對于脲酶活性，暴露時間為5 h時，脲酶活性總變化率為15.2%；暴露時間為30 h時，脲酶活性總變化率為22.4%；其余暴露時間下，脲酶活性較為穩(wěn)定，總變化率不超過±3%。對于轉(zhuǎn)化酶活性，暴露時間為30 h時，轉(zhuǎn)化酶活性總變化率為16.7%；其余暴露時間下，轉(zhuǎn)化酶活性較為穩(wěn)定，總變化率不超過±6%。

因此我們選擇暴露時間在脲酶和轉(zhuǎn)化酶活性同時穩(wěn)定的時間，并根據(jù)實驗時間要求控制污泥與藥品的暴露時間為15 h。

2.2 脲酶活性響應(yīng)

脲酶(urease)是一種能促進含氮有機物水解的水解酶，對污水中含氮有機物的分解具有重要意義[14]。脲酶活性值與布洛芬濃度有顯著的相關(guān)關(guān)系。脲酶活性動態(tài)變化率隨布洛芬濃度升高先小幅度提升，在布洛芬濃度達到28 μg·L-1后呈現(xiàn)出了單調(diào)遞減趨勢。在布洛芬濃度達到35～40 μg·L-1時，對脲酶活性的抑制程度超過了40%。試驗結(jié)果表明，28～40 μg·L-1的布洛芬對活性污泥微生物的脲酶活性有顯著的抑制作用，隨著暴露濃度的增加，持續(xù)表現(xiàn)出抑制。而布洛芬與脲酶活性總變化率的劑量-效應(yīng)圖表明，脲酶活性在0～40 μg·L-1的布洛芬暴露下總體為抑制作用，布洛芬濃度達28 μg·L-1后，

圖3 不同濃度布洛芬對污泥轉(zhuǎn)化酶活性的影響Fig. 3 Effect of different concentrations of ibuprofen on invertase activity

脲酶活性總變化率單調(diào)增加，存在顯著的劑量-效應(yīng)相關(guān)性。在布洛芬濃度達到40 μg·L-1時，脲酶活性總變化率超過了70%。實驗結(jié)果表明，布洛芬脅迫濃度較低時，受外界條件刺激微生物代謝活性增強，微生物受到外界污染物影響時，為減少對自身的毒害，需要通過代謝作用將其分解，脲酶能促進含氮有機物的水解，當活性污泥中布洛芬脅迫濃度較低時，受外界條件刺激下，微生物代謝活性增強[15]，加速了布洛芬的降解和轉(zhuǎn)化；而隨著暴露濃度的繼續(xù)增加，有毒物質(zhì)導(dǎo)致了脲酶等水解酶的活性下降，脲酶的活性呈現(xiàn)單調(diào)遞減趨勢，這是因為當活性污泥中毒物質(zhì)量過高時，會破壞微生物細胞結(jié)構(gòu)，降低其氧化代謝能力。此在實驗濃度范圍內(nèi)布洛芬的存在會影響脲酶分解含氮有機物的活性，誘導(dǎo)了不利應(yīng)激變化。閆穎等[16]的研究也發(fā)現(xiàn)低濃度除草劑阿特拉津?qū)ν寥离迕傅幕钚杂写龠M作用，而高濃度阿特拉津降低了脲酶的活性。

實驗結(jié)果也解釋了出水氨氮發(fā)生異常時，數(shù)據(jù)往往上升迅速的現(xiàn)象。通過對污染物對脲酶活性影響的分析，可較為準確和迅速地判斷污水處理的異動情況。同時可以采取及時的控制措施，縮短系統(tǒng)的恢復(fù)時間。

2.3 轉(zhuǎn)化酶活性響應(yīng)

轉(zhuǎn)化酶(invertase)可增加污泥中易溶性營養(yǎng)物質(zhì)，對污泥中的碳循環(huán)有重要作用[17]。而轉(zhuǎn)化酶活性值隨暴露濃度增加活性總體趨于穩(wěn)定，表現(xiàn)出良好的耐受性。轉(zhuǎn)化酶活性動態(tài)變化率范圍不超過±20%，轉(zhuǎn)化酶活性總變化率的變化表明，與空白相比轉(zhuǎn)化酶活性呈現(xiàn)出了一定的抑制現(xiàn)象，但總變化率變化趨勢不明顯。實驗濃度范圍內(nèi)在布洛芬濃度為35 μg·L-1時轉(zhuǎn)化酶活性總變化率達到峰值，但最大總變化率未超過30%。因此，轉(zhuǎn)化酶活性對布洛芬實驗范圍內(nèi)濃度變化不敏感。陳青林[18]的阿特拉津?qū)ν寥烂富钚杂绊懙难芯恳脖砻?，土壤脲酶對阿特拉津的敏感程度大于轉(zhuǎn)化酶對阿特拉津的敏感程度。

通過對比活性污泥中脲酶、轉(zhuǎn)化酶的活性變化率在布洛芬0～40 μg·L-1暴露下的變化，我們發(fā)現(xiàn)：不同種類酶活性對布洛芬暴露的響應(yīng)不同，隨毒性作用的不斷增強，脲酶活性先被激活，后被抑制；轉(zhuǎn)化酶活性變化不明顯。轉(zhuǎn)化酶活性動態(tài)和總變化率波動幅度均低于脲酶活性動態(tài)和總變化率，因此轉(zhuǎn)化酶活性指標在實驗濃度范圍內(nèi)對布洛芬的敏感程度低于脲酶活性指標。脲酶活性在布洛芬較低暴露濃度下明顯顯示出抑制作用，且變化幅度大、響應(yīng)快，因此推薦使用脲酶活性指標作為評價布洛芬等新型有機污染物對復(fù)雜污泥機制中活性污泥微生物活性影響的重要敏感酶指標。