劉順亮，陶峰,3，宋曉紅, 孫占學(xué),*

1. 東華理工大學(xué) 核資源與環(huán)境省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330013 2. 桂林理工大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院/廣西環(huán)境污染控制理論與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 桂林 541006 3. 湖南省核工業(yè)地質(zhì)調(diào)查院, 長沙 410011

礦業(yè)是國家經(jīng)濟(jì)的重要來源，但由于礦山開采和金屬冶煉過程中所產(chǎn)生的涉重廢水、廢渣、尾礦和降塵等廢物長期未經(jīng)處理且存在無序排放和堆存現(xiàn)象，對(duì)礦區(qū)附近的河域、農(nóng)田土壤造成了嚴(yán)重的重金屬污染，給人類的生產(chǎn)生活和健康造成嚴(yán)重威脅，也對(duì)環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)具有巨大的潛在風(fēng)險(xiǎn)[1]，故開展礦山廢水對(duì)水生生物的毒性研究具有重要的理論與應(yīng)用價(jià)值。

目前，國內(nèi)外學(xué)者在水生生物急性毒性研究中，孫翰昌等[2]曾探討過Cu2+、Cd2+、Zn2+、Pb2+4種重金屬對(duì)禾花鯉胚胎的毒性效應(yīng)；朱麗娜等[3]和童中華等[4]利用青?；【鶴67檢測了印染廢水的毒性，結(jié)果表明發(fā)光細(xì)菌法比化學(xué)參數(shù)法更能準(zhǔn)確反映廢水的毒性。Fulladosa等[5]曾以費(fèi)氏弧菌作為測試對(duì)象，研究Zn2+- Pb2+等毒性重金屬混合物的聯(lián)合效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)Zn2+- Pb2+間存在協(xié)同效應(yīng)。在低劑量輻射方面，趙維超等[6]、顏末等[7]、Kudryasheva等[8]和Selivanova等[9]分別以青?；【鶴67和海洋發(fā)光菌的生物發(fā)光強(qiáng)度作為生理活性的標(biāo)記物，研究了低劑量γ輻射和α、β輻射對(duì)菌體發(fā)光強(qiáng)度的抑制效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)發(fā)光強(qiáng)度與輻射時(shí)間呈負(fù)相關(guān)趨勢，隨輻射時(shí)間增加，抑制程度不斷增強(qiáng)。但這些關(guān)于不同類型重金屬和金屬化合物對(duì)發(fā)光菌的生物毒性效應(yīng)的研究，大多停留于非放射性元素或者某一種單獨(dú)輻射方式的研究，而關(guān)于實(shí)際鈾礦山類放射性廢水對(duì)禾花鯉及發(fā)光菌的脅迫作用與毒性研究還未見報(bào)道。

傳統(tǒng)的生物毒性研究大多停留在以單一化學(xué)物質(zhì)或幾種混合化學(xué)物質(zhì)為研究對(duì)象，而開展污染物的聯(lián)合毒性效應(yīng)研究能更真實(shí)地反映環(huán)境的綜合毒性。本研究擬通過發(fā)光細(xì)菌青海弧菌(Vibrio qinghaiensis Q67)和費(fèi)氏弧菌(Vibrio fischeri)以及禾花鯉作為受試生物代表，以實(shí)地采集的礦山廢水進(jìn)行現(xiàn)況模擬開展鈾礦山廢水的聯(lián)合生物毒性研究，對(duì)礦區(qū)廢水進(jìn)行全面的毒性評(píng)價(jià)，為礦區(qū)廢水的安全處理處置、降低其生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 廢水的采集與配制

試驗(yàn)所用礦山廢水采自南方某鈾礦工作區(qū)，樣品中重金屬離子鉛、鈾的含量檢測參考陳永欣等[10]在銅锍中鎘砷鉛鋅測定的預(yù)處理及測定方式(Optima7000DV等離子體發(fā)射光譜儀，美國PerkinElmer公司)。最后綜合檢測數(shù)據(jù)和礦區(qū)周圍水域環(huán)境監(jiān)測數(shù)據(jù)，在采集的礦山廢水中按照其Pb2+/U6+實(shí)際比例等比加入Pb(NO3)2(GR，西隴化工有限公司)和U3O8(PT，北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司)，配制成一定濃度的廢水母液，以備后期的毒性實(shí)驗(yàn)。

1.2 菌種與培養(yǎng)

青?；【鶴67(Vibrio qinghaiensis Q67)和費(fèi)氏弧菌(Vibrio fischeri)凍干粉購自華東師范大學(xué)生物系，其相關(guān)培養(yǎng)基配方及細(xì)菌培養(yǎng)方法分別見文獻(xiàn)[11]和[12]。

1.3 發(fā)光細(xì)菌急性毒性試驗(yàn)

以青海弧菌Q67(Vibrio qinghaiensis Q67)和費(fèi)氏弧菌(Vibrio fischeri)作為廢水急性毒性試驗(yàn)指示生物，通過微板分析方法[13]測定菌體在不同濃度脅迫環(huán)境中的發(fā)光強(qiáng)度。最終利用對(duì)數(shù)間距法對(duì)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，依次形成9個(gè)等比稀釋序列作為正式實(shí)驗(yàn)中兩類菌急性毒性試驗(yàn)濃度，青?；【毙远拘栽囼?yàn)中Pb2+/U6+濃度由大到小依次為2.041/1.020 mg·L-1、1.885/0.943 mg·L-1、1.742/0.871 mg·L-1；費(fèi)氏弧菌8.498/4.249 mg·L-1、6.700/3.350 mg·L-1、5.282/2.641 mg·L-1，以此類推；其中測試廢水對(duì)青?；【毙远拘詴r(shí)，采用超純水將廢水稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度，費(fèi)氏弧菌測試采用3%的氯化鈉溶液進(jìn)行稀釋。

每個(gè)濃度點(diǎn)系列設(shè)置3個(gè)平樣，平行試驗(yàn)測定結(jié)果之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差≤ 10%。在加好菌種(青海弧菌Q67為100 μL、費(fèi)氏弧菌100 μL)的測量管中，加100 μL調(diào)節(jié)好滲透壓的樣品，用復(fù)蘇稀釋液作空白對(duì)照，菌種與樣品混合后震蕩混勻，充分反應(yīng)15 min后，利用多功能微孔板檢測儀(BioTek-Synergy H4，美國Biotek公司)測定不同濃度組發(fā)光值，推算出抑制率，探討廢水對(duì)青?；【鶴67和費(fèi)氏弧菌的聯(lián)合急性毒性效應(yīng)，得出此類礦山廢水對(duì)2種發(fā)光細(xì)菌的EC50。

1.4 魚類急性毒性試驗(yàn)

試驗(yàn)所用禾花鯉幼魚購自廣東某漁場，實(shí)驗(yàn)前暫養(yǎng)2周，每日定時(shí)投食(螺旋藻育成錦飼料)一次，實(shí)驗(yàn)前停食1 d。挑選健康、活力強(qiáng)、規(guī)格相近的個(gè)體作為試驗(yàn)對(duì)象，平均體重(0.24 ± 0.05) g，平均體長(5.0 ± 0.2) cm。實(shí)驗(yàn)用水均為經(jīng)曝氣72 h除氯的自來水，pH 7.12～8.06，溶解氧 6.0 mg·L-1以上。實(shí)驗(yàn)容器為30 L體積均一的方形收納箱，室內(nèi)空調(diào)控溫，水溫控制在(13 ± 1) ℃。

正式實(shí)驗(yàn)根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，包括96 h全部存活質(zhì)量濃度上限(Pb2+/U6+=1.500/0.750 mg·L-1)和24 h全致死質(zhì)量濃度下限(Pb2+/U6+=8.496/4.249 mg·L-1)，按等對(duì)數(shù)間距設(shè)置6個(gè)試驗(yàn)濃度，每個(gè)容器放置幼魚10尾，并按魚水比為1:3的比例進(jìn)行廢水添加，每組設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)，同時(shí)設(shè)1個(gè)未染毒組為空白對(duì)照。試驗(yàn)采用靜水生物測試法，試驗(yàn)期間不喂食，試驗(yàn)開始8 h內(nèi)連續(xù)觀察幼魚行為、中毒及死亡癥狀，統(tǒng)計(jì)24 h、48 h、72 h和96 h時(shí)禾花鯉幼魚的死亡情況，并計(jì)算出死亡率、LC50和SC。觀察期間需及時(shí)清除死亡個(gè)體，判斷幼魚死亡的依據(jù)是呼吸停止，喪失游動(dòng)能力，用鑷子夾住魚尾部5 min內(nèi)魚無反應(yīng)[13]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

針對(duì)礦區(qū)廢水對(duì)青海弧菌Q67和費(fèi)氏弧菌的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果，采用Origin軟件對(duì)發(fā)光抑制率與廢水濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性函數(shù)擬合，得到其“劑量-效應(yīng)”關(guān)系曲線、擬合函數(shù)及擬合參數(shù)，計(jì)算出礦區(qū)廢水對(duì)2種試驗(yàn)菌的毒性效應(yīng)濃度EC50[14]。

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)礦區(qū)廢水對(duì)禾花鯉幼魚的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果，用概率單位回歸法[15]求出24 h、48 h、72 h、96 h試驗(yàn)魚的半致死質(zhì)量濃度(LC50)，并給出LC50的95%置信區(qū)間，并求出安全質(zhì)量濃度SC。安全質(zhì)量濃度按照特倫堡公式計(jì)算[16]：

SC=0.3×48 h-LC50/24 h-LC50/48 h-LC50

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 礦山廢水對(duì)青?；【鶴67、費(fèi)氏弧菌的急性毒性效應(yīng)

圖1和圖2分別展示了礦山廢水對(duì)青?；【鶴67與費(fèi)氏弧菌的急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果表明，礦山廢水對(duì)Q67和費(fèi)氏弧菌的毒性存在顯著的“劑量-效應(yīng)”關(guān)系，說明這2種發(fā)光細(xì)菌都能快速檢測礦山廢水的毒性。隨著廢水濃度的升高，2類細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度逐漸降低，抑制效應(yīng)不斷加強(qiáng)。2類細(xì)菌對(duì)廢水毒性敏感度之間存在較大差異，在低濃度范圍內(nèi)，即鈾含量為0～0.804 mg·L-1時(shí)，費(fèi)氏弧菌的生長繁殖活動(dòng)等受影響較小，然而對(duì)Q67卻呈現(xiàn)出很高的抑制率，高達(dá)90%；鈾含量為0.804～2.082 mg·L-1時(shí)費(fèi)氏弧菌發(fā)光抑制率急劇增大，廢水的毒性水平明顯提高，抑制率接近84%，Q67生長繁殖能力已完全喪失；隨著廢水濃度的繼續(xù)升高，費(fèi)氏弧菌的發(fā)光抑制率增勢減緩，抑制率最大值為97%。通過非線性函數(shù)擬合，廢水對(duì)青?；【鶴67和費(fèi)氏弧菌的毒性效應(yīng)濃度EC50分別為1.339 mg·L-1Pb2+、0.669 mg·L-1U6+和2.284 mg·L-1Pb2+、1.142 mg·L-1U6+。青?；【鶴67的靈敏度較高，能更好地表征礦山廢水的毒性效應(yīng)，可作為評(píng)價(jià)礦山廢水毒性風(fēng)險(xiǎn)的有效指示物。

圖1 礦山廢水對(duì)青?；【鶴67發(fā)光抑制率的影響Fig. 1 The inhibitory effects of mining wastewater on the luminescence of Vibrio qinghaiensis Q67

2.2 礦山廢水對(duì)禾花鯉幼魚的急性毒性效應(yīng)

如圖3所示，在礦山廢水對(duì)禾花鯉幼魚的急性毒性效應(yīng)研究中，各脅迫時(shí)間內(nèi)未污染對(duì)照組受體死亡率均為0，實(shí)驗(yàn)組受體死亡率與礦山廢水之間呈現(xiàn)出很強(qiáng)烈的時(shí)間-劑量-效應(yīng)關(guān)系的特征。主要表現(xiàn)為隨著廢水濃度增加和脅迫時(shí)間的延長，試驗(yàn)受體存活率大大降低，說明礦山廢水對(duì)受體具有一定的毒害效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)初期，高濃度組中受體表現(xiàn)出高頻運(yùn)動(dòng)和呼吸的機(jī)體行為以適應(yīng)環(huán)境的變化；隨著脅迫時(shí)間的推移，受體呈現(xiàn)出不同程度的中毒特征，嚴(yán)重時(shí)受體表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)遲鈍，體色變白，身體逐漸卷曲并失去平衡的行為，直至死亡。容器底物和受體表面積聚大量淡黃色粘性物質(zhì)。這與多篇報(bào)道的結(jié)果相一致[17-18]。

經(jīng)過計(jì)算，廢水對(duì)禾花鯉幼魚24 h、48 h、72 h和96 h的LC50分別為6.052 mg·L-1Pb2+-3.026 mg·L-1U6+、2.551 mg·L-1Pb2+- 1.275 mg·L-1U6+、1.979 mg·L-1Pb2+- 0.989 mg·L-1U6+和1.500 mg·L-1Pb2+- 0.75 mg·L-1U6+，安全濃度為0.136 mg·L-1Pb2+- 0.068 mg·L-1U6+。

圖2 礦山廢水對(duì)費(fèi)氏弧菌發(fā)光抑制率的影響Fig. 2 The inhibitory effects of mining wastewater on the luminescence of Vibrio fischeri

圖3 礦山廢水對(duì)禾花鯉死亡率的影響Fig. 3 Effects of mining wastewater on the mortality of Procypris merus

3 討論(Discussion)

3.1 鈾礦山廢水對(duì)2種發(fā)光細(xì)菌的急性毒性效應(yīng)

發(fā)光細(xì)菌毒性試驗(yàn)是快速檢測水體中污染物綜合毒害效應(yīng)的有效方法，目前已廣泛應(yīng)用于各種水質(zhì)綜合毒性檢測中[3]。國內(nèi)外學(xué)者利用發(fā)光細(xì)菌毒性試驗(yàn)開展了單一金屬和混合物聯(lián)合毒性的研究，朱麗娜等[3]和童中華等[4]利用青?；【鶴67檢測了印染廢水的毒性，結(jié)果表明發(fā)光細(xì)菌法比化學(xué)參數(shù)法更能準(zhǔn)確地反映廢水的毒性。Fulladosa等[5]曾以費(fèi)氏弧菌為測試對(duì)象，研究Zn2+- Pb2+等毒性濃度重金屬混合物的聯(lián)合效應(yīng)，其發(fā)現(xiàn)Zn2+- Pb2+間存在協(xié)同效應(yīng)。在實(shí)際環(huán)境中，共存的重金屬種類繁多，僅通過簡單的混合研究難以代表實(shí)際的環(huán)境，本研究中EC50較國內(nèi)相關(guān)研究及國外Microtox體系結(jié)果小，這主要說明了重金屬離子對(duì)菌種的毒害具有疊加效應(yīng)。因此，本文采用實(shí)際礦山廢水模擬開展聯(lián)合毒性研究，能更真實(shí)地評(píng)價(jià)環(huán)境中重金屬的毒性水平。

在本文中，礦山廢水對(duì)青?；【鶴67和費(fèi)氏弧菌的毒性均存在顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系，且其效應(yīng)能夠在短時(shí)間內(nèi)(15 min)顯示，說明這2種發(fā)光細(xì)菌都能快速檢測礦山廢水的毒性。但比較2種細(xì)菌在礦山廢水的急性毒性測試中的毒性效應(yīng)濃度EC50可以發(fā)現(xiàn)，青?；【鶴67的毒性效應(yīng)濃度EC50遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于費(fèi)氏弧菌，說明青?；【鶴67的靈敏度較高，能更好地表征礦山廢水的毒性效應(yīng)，可作為評(píng)價(jià)礦山廢水毒性風(fēng)險(xiǎn)的有效指示物。

3.2 鈾礦山廢水對(duì)禾花鯉幼魚的急性毒性效應(yīng)

污染物對(duì)生物的毒害效應(yīng)受污染物的理化性質(zhì)、暴露水平和暴露時(shí)間等因素的共同影響[19]，本文中礦山廢水對(duì)禾花鯉幼魚死亡率的影響呈現(xiàn)明顯的時(shí)間-劑量-效應(yīng)關(guān)系，處理組中禾花鯉幼魚的死亡率隨著廢水濃度的升高和處理時(shí)間的延長而上升，這與多篇報(bào)道的結(jié)果相一致[18-19]。孫翰昌等[2]曾研究了Cu2+、Cd2+、Zn2+、Pb2+4種重金屬對(duì)禾花鯉胚胎的單一毒性與聯(lián)合毒性，發(fā)現(xiàn)不同重金屬離子的聯(lián)合毒性具有協(xié)同作用，能增強(qiáng)其對(duì)禾花鯉胚胎的毒性。在鈾礦山廢水中鉛和鈾離子濃度較高，其對(duì)生物的聯(lián)合毒性應(yīng)引起重視。本研究中，廢水對(duì)禾花鯉幼魚的24 h和48 h半致死濃度及安全濃度均遠(yuǎn)高于孫翰昌報(bào)道的禾花鯉胚胎的數(shù)據(jù)，可能是由于幼魚對(duì)外源污染物的抵抗力高于胚胎，另外也可能與供試廢水成分和實(shí)驗(yàn)條件等有關(guān)。

綜上所述：

通過3種受試水生生物的急性毒性研究發(fā)現(xiàn)，鈾礦山廢水對(duì)水生生物的毒性存在顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系，3種受試對(duì)象均可有效指示礦山廢水的毒性水平，三者的毒性效應(yīng)濃度EC50(LC50)的大小順序?yàn)楹袒幱佐~>費(fèi)氏弧菌>青?；【鶴67，Pb2+/U6+濃度分別為6.052/3.026 mg·L-1、2.284/ 1.142 mg·L-1、1.339/0.669 mg·L-1，說明發(fā)光細(xì)菌能更靈敏地檢測礦山廢水的毒性水平，其中青?；【鶴67能更好的表征礦山廢水對(duì)環(huán)境生物的脅迫效應(yīng)。實(shí)際工作中，可通過發(fā)光細(xì)菌和魚類的急性毒性試驗(yàn)兩者相結(jié)合，綜合性地對(duì)礦山廢水的毒性風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。