楊波，倪倩，朱艷，趙歡順，楊成，段紹斌，蔣云生

（1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院 腎內(nèi)科，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院 臨床系，湖南 長(zhǎng)沙 410219；3.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院 腎內(nèi)科，湖南 長(zhǎng)沙 410011）

硫化氫（sulfuretted hydrogen,H2S）目前被譽(yù)為除一氧化氮和一氧化碳的體內(nèi)第3種氣體分子，其在多種生理病理過(guò)程中擔(dān)任著重要的角色，具有調(diào)節(jié)突觸活動(dòng)、舒張血管及抑制紅細(xì)胞氧化等重要生理功能。H2S可直接清除過(guò)氧化氫和超氧陰離子，具有強(qiáng)大的抗氧化功能。在機(jī)體內(nèi)，H2S的功能多樣，包括對(duì)抗化學(xué)性損傷，抑制化學(xué)性損傷所致心肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的凋亡作用[1]。

順鉑（Cisplatinum,DDP）是廣泛用于人類腫瘤化療的一種藥物，其抗腫瘤細(xì)胞作用主要是因?yàn)槠渑c增值細(xì)胞DNA的結(jié)合特性。然而順鉑又與許多正常細(xì)胞有親和性，從而導(dǎo)致毒性，比如腎毒性、神經(jīng)毒性、耳毒性、催吐性[2-3]，故其在化療治療中因其諸多的副作用被限制使用。而在這些副作用中，腎毒性被認(rèn)為是限制其臨床應(yīng)用的主要方面[4-5]。使用高劑量順鉑化療患者，20%出現(xiàn)腎功能不全，順鉑導(dǎo)致的腎毒性主要表現(xiàn)在小管間質(zhì)性損害[2-3]。在動(dòng)物模型中，順鉑主要損害近端小管。由于順鉑在腫瘤化療中的重要地位，有很多研究尋找相應(yīng)保護(hù)方法以減輕其腎毒性。在臨床前期研究中，提示抗氧化劑可以減少順鉑導(dǎo)致的腎毒性。

H2S對(duì)于順鉑導(dǎo)致的近端腎小管上皮細(xì)胞（human renal tubular epithelial cell,HK-2細(xì)胞）是否有保護(hù)作用，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)用H2S進(jìn)行干預(yù)，探索其對(duì)HK-2細(xì)胞是否有抗凋亡的作用，以尋求抗細(xì)胞凋亡的新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

正常人近端腎小管上皮細(xì)胞株（HK-2細(xì)胞）（美國(guó)ATCC公司），胎牛血清為四季青（浙江天杭生物科技股份有限公司），DMEM/F12培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司），二甲基亞砜（Dmethyl sulfoxide,DMSO）（美國(guó)Sigma公司），順鉑為諾欣（江蘇豪森藥業(yè)股份有限）公司，硫氫化鈉NaHS（上海紫一試劑廠）。噻唑藍(lán)[3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]（美國(guó)Amresco公司），Annexin V-FITC/PI試劑盒（上海前程生物科技有限公司），4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），6、24和96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國(guó)Coring公司）。

1.2 方法

1.2.1 DDP、NaHS的配置 將DDP配制成1 mg/ml溶液，過(guò)濾除菌分裝，置入-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩aHS配制成16 mmol/L溶液，過(guò)濾除菌分裝，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 MTT實(shí)驗(yàn) ①陰性對(duì)照組：加入等體積培養(yǎng)基；DDP組：0、1、2、5、10、20和40 mg/L；DDP+NaHS組：0 mg/L DDP+0 mmol/L NaHS、20 mg/L DDP+0 mmol/L NaHS、20 mg/L DDP+0.2 mmol/L NaHS、20 mg/L DDP+0.4 mmol/L NaHS、20 mg/L DDP+0.5 mmol/L NaHS、20 mg/L DDP+0.8 mmol/L NaHS、20 mg/L DDP+1.0 mmol/L NaHS、20 mg/L DDP+2.0 mmol/L NaHS。②將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期HK-2細(xì)胞調(diào)整密度為1×104個(gè)/ml。③加入96孔板，每孔100 μl，陰性對(duì)照組（加入等體積培養(yǎng)基）設(shè)置調(diào)零孔，對(duì)照孔，邊緣使用PBS填充。④在5%二氧化碳CO2，37℃培養(yǎng)，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（24 h），加入上述梯度濃度藥物，每孔100 μl，設(shè)立5個(gè)復(fù)孔。⑤每孔加入10 μl MTT溶液（5 mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。⑥終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，使用PBS清洗2、3遍。⑦每孔加入100 μl DMSO，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量各孔的光密度（optical density,OD）值。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)孔OD均值-空白孔OD均值）/（對(duì)照孔OD均值-空白孔OD均值）×100%。

1.2.3 DAPI、Annexin V/PI染色檢測(cè)HK-2細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 ①調(diào)整HK-2細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，接種于24孔板（板底鋪蓋玻片），每孔1 ml。②待細(xì)胞貼壁后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，予以不同干預(yù)，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。③吸棄上清，使用PBS清洗3遍。④使用雙蒸水稀釋，將5×Binding Buffer稀釋為1×Binding Buffer工作液，每孔加500 μl工作液重懸細(xì)胞。⑤每孔加入 2.5 μl Annexin V-FITC 和 5 μl PI，1 μl DAPI。⑥輕柔渦旋混勻，室溫避光5 min。⑦使用熒光顯微鏡觀察。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 ①調(diào)整HK-2細(xì)胞密度為5×105個(gè)/ml，接種于6孔板，每孔2 ml。②待細(xì)胞貼壁后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，予以不同干預(yù)，并設(shè)置不加干預(yù)因素的流式對(duì)照，一組無(wú)染色劑，一組只有Annexin V-FITC，一組只加PI，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。③培養(yǎng)結(jié)束，使用胰酶消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清，使用PBS清洗2遍。④使用雙蒸水稀釋，將5×Binding Buffer稀釋為1×Binding Buffer工作液，每管加500 μl工作液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/ml。⑤每管加入2.5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI。⑥輕柔渦旋混勻，室溫避光5 min。⑦進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單位因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組的OD值比較

使用0～40 mg/L順鉑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，結(jié)果顯示：各組的OD值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.969，P=0.000）。20 mg/L DDP組與陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.640，P =0.007）。而加用NaHS后，細(xì)胞的OD值有所上升，呈劑量改變，在NaHS為0.5 mmol/L時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-4.741，P =0.001）。但當(dāng)NaHS濃度為0.5～1.0 mmol/L，3組間OD值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.024，P =0.977）。當(dāng)NaHS為2.0 mmol/L時(shí)，OD值較1.0 mmol/L下降（t=3.785，P =0.005）。

2.2 各組HK-2細(xì)胞凋亡比較

熒光顯微鏡下，20 mg/L DDP和HK-2細(xì)胞作用24 h后，出現(xiàn)凋亡小體，表現(xiàn)為核固縮，核碎裂，形成大小不等的染色小體，但其包膜完整。DAPI染色即顯示出染色加深，Annexin-V FITC將凋亡細(xì)胞細(xì)胞膜染色成綠色（早期凋亡），PI可將核染色成紅色（晚期凋亡）。當(dāng)加入NaHS后，與DDP組比較，凋亡細(xì)胞減少，成劑量依賴性，濃度越大，凋亡細(xì)胞越少。20 mg/L DDP組平均凋亡細(xì)胞，與陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-14.130，P =0.000）。加入NaHS后，隨濃度上升凋亡細(xì)胞減少，1.0 mmol/L NaHS+20 mg/L DDP組與20 mg/L DDP組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.121，P =0.000）。見(jiàn)圖1、2和表1。

2.3 各組細(xì)胞凋亡率比較

活細(xì)胞FITC/PI均為低染（位于左下區(qū)），凋亡細(xì)胞FITC高染而PI低染（位于右下區(qū)），壞死細(xì)胞FITC/PI均高染（位于右上區(qū)）。DDP組凋亡率與陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.121，P =0.000）。DDP組高于陰性對(duì)照組。加NaHS后，凋亡率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.320，P =0.001）。隨著NaHS濃度增大，凋亡率降低，20 mg/L DDP+1.0 mmol/L NaHS組與20 mg/L DDP+0 mmol/L NaHS組比較，凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.568，P =0.010）。見(jiàn)表2和圖3。

圖1 NaHS、DDP對(duì)HK-2細(xì)胞凋亡的影響 （DAPI染色×400）

圖2 NaHS、DDP對(duì)HK-2細(xì)胞凋亡的影響 （Annexin V/PI染色×400）

表1 DDP、NaHS對(duì)HK-2細(xì)胞凋亡的影響（n=8，個(gè)，±s）

表1 DDP、NaHS對(duì)HK-2細(xì)胞凋亡的影響（n=8，個(gè)，±s）

組別 凋亡細(xì)胞陰性對(duì)照組 4.23±1.015 20 mg/L DDP組 35.02±6.079 20 mg/L DDP+0.5 mmol/L NaHS組 22.55±2.912 20 mg/L DDP+1.0 mmol/L NaHS組 9.78±2.063 F值 119.353 P值 0.000

表2 NaHS、DDP對(duì)HK-2細(xì)胞增殖的影響（n=3，±s）

表2 NaHS、DDP對(duì)HK-2細(xì)胞增殖的影響（n=3，±s）

組別NaHS/（mmol/L）凋亡率/%陰性對(duì)照組 0 5.167±0.612 20 mg/L DDP組 0 31.598±1.014 20 mg/L DDP+0.5 mmol/L NaHS組 0.5 18.375±2.239 20 mg/L DDP+1.0 mmol/L NaHS組 1.0 11.636±1.233 F值 193.344 P值 0.000

圖3 NaHS、DDP對(duì)HK-2細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

腎臟疾病作為多發(fā)病和常見(jiàn)疾病，有很高的患病率。有最新的流行病學(xué)資料顯示，我國(guó)慢性腎臟病（chronic kidney disease,CKD）患病率為10.8%。原發(fā)或繼發(fā)性因素引起急性或慢性腎損傷。當(dāng)病程超過(guò)3個(gè)月，則變?yōu)椴豢赡娴穆阅I衰竭。WHO稱每年新增腫瘤患者1 400萬(wàn)。20世紀(jì)70年代以來(lái)，DDP已被廣泛用于治療多種惡性腫瘤，其中包括睪丸癌、膀胱癌、宮頸癌、卵巢癌、頭頸部惡性腫瘤，以及小細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌等，是治療實(shí)體腫瘤最有效和常用的臨床藥物之一。但由于對(duì)正常組織中的嚴(yán)重不良反應(yīng)常限制了其臨床應(yīng)用。DDP不良反應(yīng)有腎毒性、耳毒性、骨髓抑制、胃腸道毒性、變態(tài)反應(yīng)等[6-7]，其中腎毒性最常見(jiàn)，約1/3患者出現(xiàn)急性腎損傷[6，8-9]，其劑量相關(guān)的腎毒性極大限制了臨床應(yīng)用。腎臟毒性主要發(fā)生在腎臟近端小管上皮細(xì)胞，神經(jīng)毒性主要影響神經(jīng)上下級(jí)，耳毒性主要影響耳蝸中掌握機(jī)械感覺(jué)的外毛細(xì)胞。這些都大大限制了DDP的應(yīng)用。腎臟損傷常常發(fā)生于使用標(biāo)準(zhǔn)處方量的DDP治療幾天后[10-14]，血清肌酐和血清尿素氮水平有所增加。這種腎臟損害可以導(dǎo)致陽(yáng)離子的浪費(fèi)，進(jìn)而發(fā)生糖尿和蛋白尿。DDP治療過(guò)程中最常發(fā)生的并發(fā)癥是低鎂血癥。在持續(xù)DDP治療中，可能會(huì)發(fā)生進(jìn)展性和永久性腎臟損害。目前有不少學(xué)者正在研究DDP的腎毒性發(fā)生機(jī)制，尋找防治方法及藥物。

H2S是一種有毒氣體，其無(wú)色、易溶于水，帶有特殊氣味。其在1777年由一個(gè)年輕的瑞典藥商命名，在后來(lái)的幾百年都被認(rèn)為是一種有毒的氣體。它的最大暴露值（PEL）為10 ppm，當(dāng)濃度＜400 ppm時(shí)可以導(dǎo)致人驟然死亡?，F(xiàn)在H2S被認(rèn)為是第3種氣體分子。半胱氨酸的脫巰基酶是哺乳動(dòng)物H2S的主要來(lái)源。該過(guò)程是被CBS和CSE催化。CBS在大腦中的很多區(qū)域表達(dá)，特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)[15-16]。而CSE主要在循環(huán)系統(tǒng)表達(dá)[17]。文獻(xiàn)指出，H2S對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)[18-19]、循環(huán)系統(tǒng)保護(hù)[20-21]都有很多作用。H2S被認(rèn)為的主要機(jī)制是抗氧化作用，這也是研究的一大熱點(diǎn)。H2S是強(qiáng)大抗氧化劑，可保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，有時(shí)也是強(qiáng)大的促氧化劑，可以通過(guò)ROS活化殺滅腫瘤細(xì)胞[22]。它被發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)截然不同的分子機(jī)制，抗氧化性和促氧化性，而表現(xiàn)出哪個(gè)方面，取決于當(dāng)時(shí)的內(nèi)環(huán)境。簡(jiǎn)單歸納說(shuō)，H2S可以表現(xiàn)出很多益處，比如對(duì)心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用。而更深層次地說(shuō)，還可以表現(xiàn)出毒性/細(xì)胞毒性效應(yīng)。

通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，H2S參與氧化應(yīng)激效應(yīng)并不是通過(guò)單純的機(jī)制，其中有多種信號(hào)通路參與。H2S可以通過(guò)多種酶類或者非酶類的抗氧化劑清除自由基。H2S也會(huì)抑制線粒體ROS產(chǎn)生，通過(guò)抑制p66Shc巰基。也可以通過(guò)它的化學(xué)特性減少氧自由基，其機(jī)制十分復(fù)雜。

本實(shí)驗(yàn)MTT比色法檢測(cè)DDP的濃度與HK-2細(xì)胞培養(yǎng)，隨DDP濃度上升，OD逐漸下降，示細(xì)胞凋亡增加，發(fā)現(xiàn)在DDP為20 mg/L時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)被抑制，顯示DDP對(duì)HK-2細(xì)胞的毒性作用，隨劑量增加而加重，與劑量呈正相關(guān)。在DDP為20 mg/L聯(lián)合使用NaHS后，細(xì)胞凋亡減少，并且NaHS上升后，細(xì)胞凋亡逐漸減少。提示H2S可以減輕DDP對(duì)細(xì)胞的毒害，并且與濃度有關(guān)。但在NaHS＜1 mmol/L時(shí)，對(duì)HK-2細(xì)胞的保護(hù)作用下降，NaHS保護(hù)作用下降的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

在DAPI染色和Annexin V-FITC/PI染色，早期凋亡會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞膜被染成綠色，晚期凋亡則是胞核也可以被染成紅色。實(shí)驗(yàn)顯示見(jiàn)DDP組的細(xì)胞凋亡率高于陰性對(duì)照組，在加用NaHS后，凋亡率有所下降，并且與劑量相關(guān)。Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)可更準(zhǔn)確地反映凋亡情況，可在不同象限更直觀精確地反映。在流式細(xì)胞術(shù)中，可以明顯看見(jiàn)DDP組凋亡，而加用NaHS后，凋亡明顯減少，呈劑量依賴性。

氧化還原系統(tǒng)的平衡，對(duì)細(xì)胞的生存能力和功能有至關(guān)重要的作用，是由兩個(gè)抗氧化系統(tǒng)組成（谷胱甘肽系統(tǒng)和硫氧還蛋白系統(tǒng)）組成的。活性氧系列是細(xì)胞新陳代謝正常副產(chǎn)物，比如線粒體新陳代謝或者蛋白質(zhì)折疊均可產(chǎn)生。硫氧還原蛋白系統(tǒng)，包括硫氧還原蛋白、硫氧還蛋白還原酶（TrxR）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），在細(xì)胞氧化還原信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)里扮演著一個(gè)重要的角色生長(zhǎng)和細(xì)胞凋亡。除了氧化還原調(diào)控胞內(nèi)信號(hào)，系統(tǒng)也發(fā)揮其直接抗氧化防御氧化應(yīng)激，包括清除活性氧（ROS），減少過(guò)氧化物和內(nèi)源性抗氧化劑回收。DDP導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡和ROS導(dǎo)致的p53活化有關(guān)，而H2S也會(huì)抑制線粒體ROS產(chǎn)生，通過(guò)抑制p66Shc巰基。但是H2S是否是通過(guò)這個(gè)通路來(lái)抑制DDP對(duì)細(xì)胞的毒性，仍需進(jìn)一步研究。當(dāng)NaHS濃度＜1 mmol/L時(shí)，對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用下降，可能與此有關(guān)。

DDP導(dǎo)致的腎損傷機(jī)制涉及多種途徑，如炎癥介質(zhì)、氧化應(yīng)激、壞死及凋亡、自噬等，目前仍不清楚這些因素最終整合導(dǎo)致腎損傷的具體機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)顯示H2S對(duì)DDP導(dǎo)致的HK-2細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用，但是在人體內(nèi)，機(jī)制仍不清楚。且需要考慮內(nèi)源性H2S的作用及藥物的分布等。因此對(duì)于其進(jìn)一步應(yīng)用，須繼續(xù)大量體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察。進(jìn)一步研究既保護(hù)正常組織，又不影響DDP抗腫瘤治療的方法，將有助于DDP在臨床抗腫瘤治療中的廣泛應(yīng)用。