張 泉，邱思芳，趙 逵，朱 蓉，汪煜鵬，張 海，牟蘭蘭

遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化內科，貴州遵義 563000

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是一種嚴重影響患者生活質量的疾?。?］，其發(fā)病年輕化，發(fā)病率、死亡率飆升等現狀給社會帶來巨大負擔，不斷威脅著公眾的健康。近年來，有研究發(fā)現［2-3］，CRC的發(fā)生與腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME），尤其是T淋巴細胞功能耗竭與腫瘤的免疫逃逸有關。由于正常的免疫功能與T細胞有重要聯系，故本研究主要探討CRC及其癌前病變腺瘤（colorectal adenomas）中T細胞亞群的變化及其臨床意義。

1 資料和方法

1.1 研究對象

100例CRC（癌癥組）、46例結直腸腺瘤（腺瘤組）患者均經遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院2016年1月—2017年12月術后病理確診，CRC男性51例，女性49例，年齡25～87歲，平均（57.09±11.38）歲。納入者均為術后病理學確診為CRC、結直腸腺瘤者。合并其他惡性腫瘤、合并多原發(fā)腫瘤、腺癌合并腺瘤者、人類免疫缺陷病毒（HIV）感染者、患有免疫性疾病或風濕性疾病、有服用免疫抑制劑和激素類藥物者、有嚴重感染及急慢性炎性反應疾病及因其他疾病進行放化療者均被排除。

1.2 主要試劑與儀器

CD4、CD8和CD28抗體均購自基因科技（上海）股份有限公司，雙色CD4PE/CD8FITC、雙色CD8FITC/CD28PE等流式細胞術檢測用抗體購自美國BD公司，其他試劑及儀器包括紅細胞裂解液、OLYMPUS倒置顯微鏡、FACS Clibur流式細胞儀等。

1.3 方法與步驟

1.3.1 免疫組織化學檢測

采用免疫組織化學S-P法。將石蠟塊切片至3 μm厚，切片脫蠟，3%H2O2溫育10 min，PBS液漂洗，pH為6.0檸檬酸溶液修復3 min，PBS液5 min×3次，加一抗后4 ℃冰箱過夜，復溫，PBS液10 min×3次，添加二抗于37 ℃溫育30 min，PBS液10 min×3次，DAB顯色，蘇木精復染，1%鹽酸乙醇溶液分化，脫水、干燥及封片，鏡檢。用PBS代替一抗作陰性對照。每張切片先用低倍鏡找到相關組織，再用高倍鏡隨機選擇5個視野，根據組織細胞的染色強度和細胞數來綜合評分［4］：

① 染色強度評分為0分：無染色；1分：輕度染色；2分：中度染色；3分：深度染色。② 陽性細胞數評分0分0～5%；1分：6%～25%；2分：26%～50%；3分：51%～75%；4分：＞75%。最終結果為兩者相乘得分為0分：陰性（記為0分）；1～2分：弱陽性（記為1分）；3～4分：中等陽性（記為2分）；5～9分：強陽性（記為3分）。結果判讀：0～1分為陰性表達，2～3分為陽性表達。結果判定：CD4+和CD8+T淋巴細胞主要定位于細胞膜，CD28+T淋巴細胞主要定位于細胞膜和細胞質，分布在單直管狀腺腔之間，CD4+和CD28+T淋巴細胞呈黃色或褐黃顆粒，CD8+T淋巴細胞呈棕黃色顆粒。

1.3.2 流式細胞術檢測步驟

所有標本均為空腹下，用含EDTAK2的一次性真空管采集受檢者肘靜脈血，4 h內上機。手術后標本為患者手術后接受化療前標本。將100 μL抗凝血分別加入3個1.5 mL EP管中，一管加入CD4與CD8抗體各20 μL，另一管加入CD8和CD28抗體各20 μL，另一管為陰性對照，室溫避光溫育30 min，后加入紅細胞裂解液450 μL，振蕩，室溫避光溫育10 min，離心（1 500 r/ min，10 min），棄上清液，再加入紅細胞裂解液300 μL，振蕩混勻，室溫避光溫育5 min，離心（1 500 r/min，5 min），棄上清液，加入300 μL PBS緩沖液，上機檢測。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 健康人、腺瘤和CRC組織中CD4+、CD8+及CD28+T細胞陽性率的比較

對照組、腺瘤組和癌癥組中CD4+T細胞表達率分別為90.00%、43.75%及32.65%，三者比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。3組中CD8+T細胞表達率分別是30.00%、56.25%及75.51%，3組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。3組中CD28+T細胞表達率分別為42.86%、30.00%及20.00%，三者比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表1和圖1～4）。

2.2 CD4+、CD8+、CD28+T淋巴細胞陽性率與CRC臨床病理參數比較

結果顯示，CD4+、CD8+T淋巴細胞表達與腫瘤的分期、淋巴結及遠處轉移有關（P ＜0.05）。CD28+T淋巴與腫瘤的部位、分期及遠處轉移有關（P＜0.05，表2）。

表 1 3組中CD4+、CD8+和CD28+T淋巴細胞的陽性率比較Tab. 1 Comparison of expression levels of CD4+, CD8+, and CD28+ T lymphocytes among three groups［n (%)］

圖 1 CD4+、CD8+及CD28+T淋巴細胞在正常結直腸組織中的陰性對照Fig. 1 Negative control of CD4+, CD8+, CD28+T lymphocytes in normal colorectal tissue

圖 2 CD4+T淋巴細胞在對照組、腺瘤組織及腺癌組織中的染色情況Fig. 2 Staining of CD4+ T lymphocytes in control, adenoma and adenocarcinoma

圖 3 CD8+T淋巴細胞在對照組、腺瘤組織及腺癌組織中的染色情況Fig. 3 Staining of CD8+ T lymphocytes in control, adenoma, andadenocarcinoma

圖 4 CD28+T淋巴細胞在對照組、腺瘤組織及腺癌組織中的染色情況Fig. 4 Staining of CD28+ T lymphocytes in control, adenoma andadenocarcinoma

表 2 CRC患者不同臨床資料中3種T淋巴細胞陽性率的比較Tab. 2 Comparison of positive rates of the three subsets of T lymphocytes in diあerent clinical data of CRC patients［n (%)］

2.3 T細胞亞群在對照組、腺瘤組、癌癥組及癌術后患者外周血的測定情況

4組人外周血T細胞亞群細胞數測定的比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且從對照組、腺瘤組及癌癥組中出現CD4+、CD4+/CD8+T淋巴細胞比值、CD28+、CD8+CD28+及CD8－CD28+T細胞呈逐漸降低的趨勢，而CD8+、CD8+CD28－T細胞呈逐漸升高的趨勢（表3）。

2.4 T細胞亞群和CRC臨床病理參數比較

外周血中除CD4+T淋巴細胞與淋巴結轉移、CD8+CD28－與性別有關（P＜0.05）外，余CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD28+、CD8+CD28+、CD8+CD28－及CD8－CD28+T淋巴細胞與CRC的臨床病理參數性別（CD8+CD28－T淋巴細胞除外）、年齡、部位、分期及分化程度和淋巴結轉移（CD4+T淋巴細胞除外）均無關（P＞0.05，表4）。

表 3 T細胞亞型在4組患者外周血中含量的比較Tab. 3 Comparison of T cell subsets in peripheral blood of four groups (%，±s)

表 3 T細胞亞型在4組患者外周血中含量的比較Tab. 3 Comparison of T cell subsets in peripheral blood of four groups (%，±s)

Group Number n T lymphocytes CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ CD28+ CD8+CD28+ CD8+CD28- CD8-CD28+Control 20 44.70±5.30 30.88±4.91 1.50±0.36 55.36±11.20 14.40±5.01 19.87±9.62 42.77±8.72 Adenoma 10 36.02±5.08 40.51±6.06 0.91±0.21 46.36±17.44 11.84±7.34 25.27±9.01 34.45±12.25 Cancer 30 31.92±6.75 40.68±8.54 0.83±0.27 45.54±9.67 11.27±2.87 29.09±9.60 32.46±7.50 Postoperative 15 33.88±7.18 40.32±5.58 0.86±0.24 48.32±10.17 10.01±4.86 29.67±8.34 34.33±11.19 P value 0.001 0.001 0.001 0.030 0.031 0.004 0.003

表 4 不同臨床資料中結直腸癌患者外周血T淋巴細胞亞型含量的比較Tab. 4 Comparison of T lymphocyte subsets in peripheral blood of patients with colorectal cancer in diあerent clinical data

3 討 論

TME被認為是腫瘤“溫育床”［5］，T細胞亞群是其關鍵的成員。當腫瘤逃避初始免疫監(jiān)測，其可直接抑制T細胞浸潤、活化和效應功能，從而使人體產生免疫耐受，最終導致無效的免疫應答和腫瘤進展［6］。T細胞依據表面抗原差異可包括CD4+和CD8+T細胞［7］,兩者數量平衡的穩(wěn)態(tài)使機體有穩(wěn)定的正常免疫功能，且二者比值是評估免疫功能的重要指標［8］。CD4+、CD8+T細胞對細胞內病原體感染的細胞識別和清除是重要的［9］，且CD8+T細胞是抗腫瘤免疫應答的關鍵參與者。CD8+T細胞根據是否表達CD28，可分細胞毒T細胞（cytotoxic T lymphocyte，Tc，即CTL）和CD8+CD28－調節(jié)性T細胞（regulatory T lymphocyte，Ts，即Treg），前者是重要的殺傷效應細胞，后者是具有正/負調節(jié)功能的免疫細胞。CD8+CD28+與腫瘤接觸后，釋放穿孔素等毒性物質，溶解靶細胞且可增強機體抗病毒感染和對腫瘤的殺傷功能，承擔免疫防御和免疫監(jiān)視的功能［10-11］。

既往研究發(fā)現［12］，CRC外周血中CD4+、CD4+/CD8+T淋巴細胞比值下降，CD8+T淋巴細胞含量升高。也有文獻報道，在TME內功能有效的CD8+T細胞是減少的［13］。然而，最新研究認為［14］，CRC外周血和組織中的CD8+T細胞的數量與健康人是相當的。本次實驗結果表明，較健康人比，結直腸腺瘤和癌患者外周血和組織中CD4+T細胞數量逐漸降低，CD8+T細胞則逐漸增加。但我們認為，根據腫瘤免疫逃逸機制，CRC及腺瘤增加的CD8+T細胞是無功效的，有功效的CD8+T細胞實際上是降低的。在CRC及腺瘤中，CD4+T細胞減少是由于CRC細胞通過Fas/Fas L途徑抑制宿主的免疫［15］。而腫瘤細胞產生降解色氨酸和精氨酸的酶和免疫細胞爭奪營養(yǎng)和氧氣，產生高濃度的乳酸鹽等使CD8+T細胞在腫瘤微環(huán)境影響下逐漸失去功能［16］。此外，腫瘤組織中CD8+T細胞的存在可以避免遠處轉移的發(fā)生。故在對結腸癌等腫瘤治療時，腫瘤中高CD8+T細胞浸潤常作為預后良好的指標［17］。

文獻報道［18］，在胃癌外周血中CD8+CD28+T細胞數量是降低的，且較CD8－CD28+而言，CD8+CD28+更能反映患者的免疫狀態(tài)［7］。王桂玲［19］發(fā)現胃癌患者腫瘤組織CD8－CD28+、CD8+CD28+較切緣組織明顯降低。劉曉光等［11］發(fā)現，較健康人相比，CRC患者CD8+CD28－增高、CD8－CD28+降低。本次報道發(fā)現，腺瘤組和癌組患者外周血中的CD28+、CD8+CD28+、CD8－CD28+較健康人明顯降低，CD8+CD28－較健康人逐漸升高。既往有研究發(fā)現［20］，流式細胞術檢測CD28+、CD8+CD28+T細胞的陽性率與CRC的Dukes分期、淋巴結轉移等臨床病理參數等是有相關性的。但是，本次研究中尚未發(fā)現CD28+、CD8+CD28+T細胞與CRC臨床病理參數相關，這可能與本次研究樣本偏小，采集血液時間、檢測時間及所檢測患者機體內環(huán)境等有關，需進一步加大研究樣本及深入研究。

CRC外周血中CD28+T細胞數量降低，可能原因為CRC中腫瘤細胞抗原性弱對免疫因子的低表達。CD8+CD28+降低主要是由于TME的變化引起。CD8+CD28+殺傷腫瘤細胞過程如下［21］：① CD8+CD28+T細胞受體識別腫瘤細胞上的特異性抗原，且在Th細胞的幫助下活化，進一步殺傷腫瘤細胞；② 活化的CD8+CD28+釋放穿孔素，分泌IFN且高表達FasL，使靶細胞溶解，從而殺傷腫瘤細胞。CD8+CD28－在癌及癌前病變中增加，這可能是由于在持續(xù)的抗原刺激下發(fā)生激活循環(huán)，且每次重復刺激CD28表達增殖在CD8+T細胞表面上，后逐漸不可逆地下調T細胞，最終導致CD8+CD28-T細胞的積累［22］。

本次實驗中，我們發(fā)現在結直腸腺瘤中，T細胞亞群的變化均是介于CRC和健康人之間，推測在癌前病變中已有TME的變化，但是尚未引起足夠重視，若能進一步深入研究，臨床診療中在癌前病變時已發(fā)現TME的變化并進行干預，對于CRC的診治及療效可能有重大意義。

綜上，TME的T細胞亞群在惡性腫瘤形成過程中起重要作用。有學者提出［23-24］CRC中T細胞亞群在腫瘤細胞和基質細胞中表現出不同侵襲行為。在腫瘤形成后，隨著腫瘤細胞的不斷出現，機體的免疫系統(tǒng)與其進行博弈，不斷糾正，以適應并達到機體穩(wěn)態(tài)。關于T細胞與結直腸疾病發(fā)生的聯系與規(guī)律，需進一步探索與干預。