張美蘭，沈哲式，張英哲，金仁順

(延邊大學附屬醫(yī)院病理科，吉林 延吉 133000)

結核病(tuberculosis)是由結核分枝桿菌感染引起的一種慢性肉芽腫性病，以肺結核病最為常見，但亦見于全身各臟器和器官，危害性極大。雖然近年國內部分省結核病得到有效的控制，呈穩(wěn)定下降趨勢,但我國還是全球結核病流行嚴重的國家之一[1-4]。為了促進我國結核病病理學診斷水平，2017年中華醫(yī)學會提出了“中國結核病病理學診斷專家共識”。共識提出了結核病的病理診斷標準，即在結核病基本病理變化的基礎上，結核分枝桿菌基因檢測陽性才能做出明確的結核病診斷[5]。結核病的分子病理學檢測方法有多種，其中實時熒光定量PCR(FQ-PCR)方法已被廣泛利用于臨床[6-8]，但檢測痰、血液、胸腹腔積液和腦脊液等標本中的結核分枝桿菌陽性率較低。本試驗對組織學上診斷為結核病以及伴有壞死、肉芽腫但不能明確診斷結核病的石蠟包埋組織標本，采用FQ-PCR技術進行結核桿菌核酸檢測，與抗酸染色的結果進行對比分析，探討FQ-PCR技術在結核病診斷中的價值。

1 資料與方法

1.1標本來源： 選擇2014年5月～2017年11月間我院手術切除、手術活檢和穿刺活檢，并在病理科進行常規(guī)切片染色后診斷為結核病的87例及伴有少量壞死和肉芽腫性炎，但在組織學上不足診斷結核病的病例58例做對照，具體的標本來源見表1。145例中男77例，女68例，對所有標本進行FQ-PCR檢測，其中對49例同時做抗酸染色進行對比。

1.2FQ-PCR結核分枝桿菌檢測方法：將石蠟包埋組織切8～10片，厚度為5～10 μl，放入離心管中加入1 ml二甲苯脫蠟，加入1ml無水乙醇離心進行脫水，之后加入20 μl蛋白酶K提取石蠟包埋組織中的DNA；利用實時熒光定量PCR儀(ABI7500)進行擴增檢測，反應體系為40 μl：TB PCR反應液37.8ul，Taq酶0.2 μl，UNG 0.06 μl，樣本2 μl。循環(huán)條件：37℃，5 min；94℃，1 min；95℃，5 sec；60℃，30 sec，40個循環(huán)。

1.3結果判讀：檢測樣本Ct值為40，0或無數(shù)值報告為陰性，見圖1；檢測樣本Ct值≤37.0，且有典型的S型曲線，為陽性，見圖2；檢測樣本Ct值>37.0重新檢測，若樣本Ct值<40可報告為陽性，否則為陰性。

1.4抗酸染色：石蠟組織3～4 μm厚切片，用汽油松節(jié)油脫蠟，按照試劑盒說明進行染色，陽性判讀標準：結核分枝桿菌呈紅色，長約3 μm，呈纖細而微彎的桿狀物或串珠狀物，也可以長或較短粗，散在或成堆排列，其他細菌及細胞呈藍色，在高倍鏡下觀察全部切片，未發(fā)現(xiàn)者判為陰性，找到>3條判為陽性。

表1145例標本來源及病理診斷為結核病的87例FQ-PCR檢測結果[例(%)]

部位總例數(shù)結核例數(shù)陽性陰性肺及胸壁605044(88.0)6(12.0)淋巴結1676(85.7)1(14.3)鼻咽、扁桃體974(57.1)3(42.9)附睪,腎1265(83.3)1(26.7)腸、大網膜1363(50.0)3(50.0)子宮、乳腺633(100.0)0(0.0)皮下組織1500(0.0)15(0.0)其他1485(62.5)3(37.5)合計1458770(80.5)17(19.5)

注：其他部位包括涎腺、腹腔、盆腔、脾臟、前列腺等

圖1 TB-DNA 陰性曲線

圖2 TB-DNA 陽性曲線

1.5統(tǒng)計學方法：采用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

在145例檢測標本中74例FQ-PCR檢測結果陽性，占51%，在組織學上診斷為結核病的87例中70例為陽性，陽性率為80.5%(70/87)，其中肺及胸壁陽性率最高(62.9%)，其次是淋巴結(8.6%)，見表1，在組織學上無足夠證據(jù)診斷結核，考慮為慢性潰瘍，結節(jié)病和慢性肉芽腫性炎的4例，F(xiàn)Q-PCR檢測呈陽性。同時進行抗酸染色的49例標本中，單純抗酸染色陽性者14例，占28.6%，其陽性率明顯低于FQ-PCR染色，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，兩種檢測方法同時陽性者9例，占78.5%，有較高的一致性。見表2、3。

表2FQ-PCR及抗酸染色檢測結果(例)

臨床診斷例數(shù)FQ-PCR + - 例數(shù)抗酸染色 + - 結核877017321121非結核5845417314合計1457471491435

表3抗酸染色與 PCR檢測結果的關系(例)

抗酸染色FQ-PCR 陽性 陰性 合計陽性113 14陰性211435合計321749

3 討論

近年我國結核病發(fā)病率穩(wěn)步下降，但肺結核患者數(shù)仍居全球第二位[4]。臨床常用的結核病原體檢查方法是痰、胸腹水、血液中的結核分枝桿菌培養(yǎng)法，但培養(yǎng)時間長，敏感度低。在組織學上典型的結核病易診斷，但隨著非結核分枝桿菌的感染率上升及不典型結核病變以及耐藥結核病患者增加[9]，有時單靠組織學特征診斷困難。

本文選擇在組織學上診斷為結核病的87例蠟塊組織，進行FQ-PCR法檢測，結果發(fā)現(xiàn)70例呈陽性，陽性率為80.5%，在陽性標本中肺和胸膜組織最多，其陽性率也最高，其次是淋巴結、鼻咽和扁桃體等，提示肺結核病為最常見。近年隨著支氣管鏡的廣泛開展，肺黏膜活檢越來越多，因此，在肺活檢標本中結核病檢出率越來越高[10]，本組FQ-PCR法檢測陽性標本中有11例為肺活檢標本，部分病例在組織學上僅見少量類上皮樣細胞及小的結核樣結節(jié)，但FQ-PCR法檢測均為陽性，因此，認為FQ-PCR檢測方法敏感性高，尤其對小標本的檢測值得臨床推廣。近年來，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)喉、扁桃體等開放性臟器的結核病，但這些部位的結核病臨床癥狀不典型，取活檢困難，標本小，有時在傳統(tǒng)的HE染色上病變不典型診斷更困難。本組中7例疑結核病的扁桃體、喉和會厭活檢小標本中4例為陽性，最后可以明確結核病的診斷。

抗酸染色作為病理診斷的輔助檢查方法已廣泛應用于臨床，但有局限性。此染色不僅結核分枝桿菌呈陽性，而非結核分枝桿菌如麻風桿菌也呈陽性。另外，因桿菌較小在鏡下觀察有一定的難度，并具有觀察者的主觀差異，尤其是活檢小標本菌量少的易漏診[10]。本文中筆者對49例同時進行抗酸染色和FQ-PCR檢測進行對比，結果發(fā)現(xiàn)TB-DNA陽性率明顯高于抗酸染色，提示FQ-PCR檢測石蠟組織中的結核桿菌具有靈敏度高、特異性強，優(yōu)于抗酸染色，并可以區(qū)分結核桿菌與非結核桿菌，提高結核桿菌的檢出率[6-8，10]。本組中2例肺組織和1例胸膜組織抗酸染色陽性，但FQ-PCR陰性，其可能原因是：①可能其他抗酸染色陽性的分枝桿菌感染；②活檢小標本因組織過小、組織較大的蠟塊在切取蠟塊組織時修片過多，導致在FQ-PCR檢測用的組織片里沒有病變組織；③FQ-PCR操作原因：在核酸提取過程中，因組織小丟失DNA、提取不純、或抑制物影響擴增等原因均可導致假陰性。通過本研究筆者認為對小活檢或穿刺標本石蠟不要進行修片，盡可能提高模板DNA的含量；對組織較大的蠟塊標本，對照常規(guī)HE染色進行修片，以便提高陽性率。

綜上所述，利用FQ-PCR技術檢測石蠟組織中的結核分枝桿菌，具有靈敏度高，特異性強的特點，但也可能存在假陰性，因此，應在病理形態(tài)學的基礎上結合抗酸染色，嚴格遵守FQ-PCR操作規(guī)范，以便提高結核分枝桿菌檢出率及診斷率。