余軍輝，應(yīng)柳青，王珺

不孕癥屬于婦科常見(jiàn)疾病，臨床發(fā)病率達(dá)到10%～25%[1]。經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的檢查程序后，多數(shù)可明確病因；但仍有10%～26%不孕癥患者原因不明。近年來(lái)隨著輔助生殖技術(shù)的應(yīng)用，不孕患者的妊娠率從15%～20%提高到了32.5%，但相對(duì)來(lái)說(shuō)其胚胎植入效率仍相對(duì)較低[2]。不孕癥患者中約三分之一是由于胚胎的卵母細(xì)胞出現(xiàn)異倍性現(xiàn)象或者染色體畸形而引起的，但其中三分之二都是因?yàn)樽訉m內(nèi)膜的容受性而引起的[3]。隨著醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)财诟鞣N調(diào)節(jié)因素的研究開(kāi)始深入，發(fā)現(xiàn)引起不明原因不孕癥的病因可能是由于患者子宮內(nèi)膜局部調(diào)節(jié)失衡[4]。因此，本實(shí)驗(yàn)將著重研究抑抗湯對(duì)于改變白血病抑制因子（LIF）水平與提高胚胎著床率的機(jī)制，具體報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物與藥物 選取8～12周齡、體質(zhì)量25～30g、無(wú)特定病原體ICR雌鼠74只。按照隨機(jī)數(shù)字表法分為A組與B組。A組大鼠體質(zhì)量（27.54±2.32）g，周齡（10.26±1.63）周；B組大鼠體質(zhì)量（27.60±2.29）g，周齡（10.32±1.58）周。兩組大鼠體質(zhì)量、周齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 配置抑抗湯 選用白芍、山藥、生地黃、赤芍、菟絲子、當(dāng)歸各10g，春柴胡、山茱萸，甘草各3g，采用水煎醇沉工藝煎煮配制中藥，配置完成后對(duì)抑抗湯進(jìn)行低溫保存。選取其他實(shí)驗(yàn)所用藥劑。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的分離與制備 A組每天灌胃0.9%氯化鈉注射液0.8 ml，B組連續(xù)每天定時(shí)（16時(shí)）以0.8 ml抑抗湯灌胃給藥。1個(gè)月后均于末次給藥1 h后，頸椎脫臼處死，立即心臟采血。低溫－4℃離心（4000r/min）20min，吸取上清液。56°水浴30 min滅活，0.22m一次性濾器過(guò)濾除菌，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

重新選擇74只雌鼠，按照奇數(shù)與偶數(shù)分為對(duì)照組和研究組。對(duì)照組大鼠體質(zhì)量（26.78±1.67）g，周齡（9.65±1.48）周；研究組大鼠體質(zhì)量（27.09±1.85）g，周齡（9.58±1.53）。兩組大鼠體質(zhì)量、周齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

按雌雄比例（1～2）∶1合籠，次日晨查雌鼠陰道，發(fā)現(xiàn)陰栓者計(jì)為妊娠第1天；均于妊娠第4天將雌鼠頸椎脫臼處死，迅速無(wú)菌取出子宮組織，置于4℃遇冷的PBS中，去除脂肪厚組織后，清洗，將子宮沿長(zhǎng)軸剖開(kāi)，置于含 HBSS 4 ml，Trypsin（10%）1 ml的消化液中消化4℃1h→20℃1h→37℃10min；消化結(jié)束后采用低速離心的方法收集子宮內(nèi)膜細(xì)胞，放置在37℃孵箱中處理。取已制備好的抑抗湯含藥血清和0.9%氯化鈉注射液灌胃血清，分別對(duì)對(duì)照組與研究組的妊娠第4天大鼠的子宮內(nèi)膜細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 觀察指標(biāo) 對(duì)照組和研究組子宮內(nèi)膜的黏附能力及LIF與整合素av 3蛋白的表達(dá)水平。子宮內(nèi)膜細(xì)胞黏附能力通過(guò)組內(nèi)設(shè)30、60、90、120min及參照組，每組3個(gè)復(fù)孔，ELISA方法進(jìn)行測(cè)定；LIF與av 3蛋白通過(guò)Western blot法進(jìn)行測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用2檢驗(yàn)。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

研究組的子宮內(nèi)膜細(xì)胞 av 3蛋白水平與基質(zhì)間黏附力均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

隨著時(shí)間增加，兩組細(xì)胞培養(yǎng)液中LIF蛋白水平都有所增加，研究組細(xì)胞培養(yǎng)液中LIF水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表2。

3 討論

一次成功的妊娠需要良好的胚胎及子宮內(nèi)膜容受性，臨床治療中經(jīng)常有部分患者由于既往內(nèi)膜反復(fù)刮宮導(dǎo)致內(nèi)膜受損傷，在超聲檢測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜薄，采用試管方案仍無(wú)法達(dá)到理想的效果。子宮內(nèi)膜完全脫落，將有利于新的內(nèi)膜生長(zhǎng)起來(lái)；但部分患者內(nèi)膜不能完全脫落，將對(duì)內(nèi)膜容受性造成影響。因此，需要研究一種行之有效的辦法改善患者的子宮內(nèi)膜容受性。

胚胎的成功著床即子宮內(nèi)膜變?yōu)榻邮軕B(tài)、胚胎發(fā)育成為植入態(tài)，即子宮內(nèi)膜與胚胎要同步發(fā)育；因此，子宮內(nèi)膜的容受性是胚胎可成功著床的關(guān)鍵[5]。以往體外受精-胚胎移植失敗的案例中，2/3的患者都是由于患者子宮內(nèi)膜容受性發(fā)生變化而導(dǎo)致的失敗?；颊唧w內(nèi)的激素、細(xì)胞因子與黏附分子等多種因素都可影響子宮內(nèi)膜容受性的形成[6]。

LIF是目前國(guó)內(nèi)外生殖領(lǐng)域的熱門研究因子，可維持胚胎干細(xì)胞保持未分化狀態(tài)[7]。在生殖過(guò)程中LIF可以發(fā)揮重要作用，但其工作時(shí)各類調(diào)控信號(hào)的具體作用、途徑與交互網(wǎng)絡(luò)機(jī)制都還未闡明。LIF在子宮內(nèi)膜表面表達(dá)調(diào)節(jié)時(shí)，其采用的上游信號(hào)系統(tǒng)與發(fā)揮功能的下游信號(hào)系統(tǒng)還未形成完備理論網(wǎng)絡(luò)，基因表達(dá)的具體分子機(jī)制需進(jìn)一步研究[8]。近年來(lái)，醫(yī)學(xué)屆加大對(duì)抑抗湯的研究，就如何改變LIF水平與提高胚胎著床率的機(jī)制進(jìn)行了更多相關(guān)實(shí)驗(yàn)，力求進(jìn)一步證明傳統(tǒng)中醫(yī)藥與現(xiàn)代胚胎移植技術(shù)相結(jié)合后可顯著提高胚泡著床障礙不孕癥婦女的孕育成功率，從而尋找到一條新的治療女性不孕癥的途徑[9]。

整合素是一種受體，參與細(xì)胞與外界環(huán)境的過(guò)程，可連接介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）等，是細(xì)胞表面可以黏附的分子之一?？缒ば盘?hào)的傳導(dǎo)過(guò)程如細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與機(jī)制、細(xì)胞基質(zhì)-細(xì)胞間進(jìn)行識(shí)別時(shí)都需要整合素的參與，可以迅速適應(yīng)環(huán)境發(fā)生的變化[10]。本文研究的av 3又稱玻璃黏附蛋白受體，女性排卵5～6 d即胚胎著床期時(shí)，av 3可以在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。女性子宮內(nèi)膜容受性的檢驗(yàn)指標(biāo)之一就是av 3的含量，其在子宮內(nèi)膜內(nèi)的表達(dá)與LIF分泌具有一致性，存在時(shí)間與空間的特異性。

表1 兩組子宮內(nèi)膜細(xì)胞av 3蛋白水平與基質(zhì)間黏附力比較 %

表2 兩組細(xì)胞培養(yǎng)液中LIF水平比較 ng/ml

抑抗湯具有補(bǔ)腎、活血化瘀及清利濕熱等功效，而中醫(yī)認(rèn)為著床困難及免疫性不孕癥則是由于腎虛、淤血或濕熱等原因引起，因此抑抗湯對(duì)于胚胎著床困難即子宮內(nèi)膜容受性有作用[11]。本次實(shí)驗(yàn)中對(duì)兩組子宮內(nèi)膜細(xì)胞 av 3蛋白水平與基質(zhì)間黏附力進(jìn)行比較，研究組的子宮內(nèi)膜細(xì)胞av 3蛋白水平與基質(zhì)間黏附力均顯著高于對(duì)照組（＜0.05）；隨著時(shí)間增加，兩組細(xì)胞培養(yǎng)液中LIF蛋白水平都有所增加，研究組細(xì)胞培養(yǎng)液中LIF水平顯著高于對(duì)照組（＜0.05）。本實(shí)驗(yàn)可證明抑抗湯含藥血清對(duì)于子宮內(nèi)膜的容受性具有顯著改善作用。

綜上所述，抑抗湯可能對(duì)于對(duì)細(xì)胞的黏附功能有所增強(qiáng)，從而增加女性體內(nèi)LIF水平與av 3蛋白的表達(dá)，從而改善對(duì)子宮內(nèi)膜容受性。