鄧海蓮,胡 蝶,鄒婷婷,*,劉少敏,宋煥祿,潘文清,龔 林

(1.北京工商大學(xué)食品學(xué)院,北京 100048; 2.湖南省嘉品嘉味生物科技有限公司,湖南常德 415401)

骨素是以動(dòng)物鮮骨為原料,經(jīng)粉碎、提取、分離、真空濃縮和高溫殺菌等工藝抽提得到的風(fēng)味抽提物,富含天然呈味物質(zhì),具有很強(qiáng)的風(fēng)味增強(qiáng)效果,因此在日本、韓國(guó)等東南亞及西方發(fā)達(dá)國(guó)家得到廣泛應(yīng)用。目前我國(guó)許多肉制品和速食面生產(chǎn)廠家通過(guò)使用骨素來(lái)提高產(chǎn)品的等級(jí)[1-2],但骨素風(fēng)味單一且香氣不足,后期應(yīng)用過(guò)程中需要做生香處理,而美拉德(Maillard)反應(yīng)作為生香反應(yīng)的主要方式對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的形成起到重要的調(diào)節(jié)作用,是骨素精深加工的必要途徑[3]。

對(duì)骨素制備美拉德反應(yīng)香精最常用的處理方式就是酶解,董憲兵[4-5]等研究了雞骨素開發(fā)過(guò)程中蛋白酶的選擇和酶解工藝,發(fā)現(xiàn)雞骨素中蛋白質(zhì)含量高脂肪含量低,氨基酸種類齊全,有很大的市場(chǎng)應(yīng)用前景。陳怡穎等[6]對(duì)雞肉及其酶解液的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行了對(duì)比分析,發(fā)現(xiàn)酶解可以雞肉中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。孫紅梅等[7-9]研究了雞骨素酶解液美拉德反應(yīng)的工藝條件,并對(duì)雞骨素及其酶解液的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物揮發(fā)性風(fēng)味成分和滋味成分比較分析,發(fā)現(xiàn)酶解可以增加骨抽提物中多肽及游離氨基酸的含量,使后期美拉德反應(yīng)得到的肉味香精風(fēng)味更加圓潤(rùn)、醇厚,烤香味、脂香味、肉香味突出。張永生等[10]研究了酶解雞肉對(duì)燉煮風(fēng)味雞肉香精的影響,酶解后的熱反應(yīng)香精風(fēng)味明顯,醇厚感好。多項(xiàng)研究表明,酶解可以增加雞肉和雞骨素基料的物質(zhì),使美拉德反應(yīng)產(chǎn)物得到的香精更醇厚。但是,目前對(duì)比不同類型的雞骨素與其酶解液的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的揮發(fā)性風(fēng)味成分的研究較少。

本文利用固相微萃取/氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)雞骨素及其酶解液的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析,來(lái)闡述酶解對(duì)骨素美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的揮發(fā)性風(fēng)味成分的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

清湯型雞骨素、白湯型雞骨素、植物水解蛋白(HVP) 湖南省嘉品嘉味生物科技有限公司;復(fù)合風(fēng)味蛋白酶(500 LAPU/g)、復(fù)合蛋白酶(1.5 AU/g) 丹麥諾維信公司;D-(+)-木糖、甘氨酸 源葉生物科技有限公司;L-半胱氨酸、丙氨酸 河北百味生物科技有限公司;硫胺素(VB1) 河南興源化工產(chǎn)品有限公司;核苷酸二鈉(I+G) 廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司;葡萄糖 青島佰仁生物科技有限公司;C7～C30系列烷烴、2-甲基-3-庚酮 美國(guó)Sigma公司。

BSA224S-CW電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋、JI-1精密增力電動(dòng)攪拌器 國(guó)華電器有限公司;YX-18DJ型YX系列手提式壓力滅菌鍋 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司;7890A-7000B氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司;Sniffer9000嗅聞儀 瑞士Brechbuhler公司;SPME自動(dòng)進(jìn)樣手柄、SPME萃取纖維頭(DVB/CAR/PDMS涂層) 美國(guó)Supelco公司;毛細(xì)管柱DB-Wax及DB-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm) 美國(guó)J&W公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雞骨素酶解液的制備 清湯型雞骨素蛋白質(zhì)含量27.3%±0.3%,可溶性固形物含量42%,含2%油脂;白湯型骨素蛋白質(zhì)含量7.8%±0.42%,可溶性固形物含量47.5%,含28%油脂。根據(jù)查閱文獻(xiàn)[4,10-12]及實(shí)驗(yàn)室前期工作優(yōu)化得到的工藝條件,雞骨素酶解液制備條件:清湯型骨素加入4‰復(fù)合風(fēng)味蛋白酶和6‰復(fù)合蛋白酶,在55 ℃水浴條件下酶解3h;白湯型骨素加入4‰復(fù)合風(fēng)味蛋白酶和2‰復(fù)合蛋白酶,在55 ℃水浴條件下酶解6 h,在酶解過(guò)程中用電動(dòng)攪拌器攪拌。

表1 雞肉香精感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[9,13-14]Table 1 Sensory evaluation criteria for chicken flavor[9,13-14]

1.2.2 熱反應(yīng)香精制備方法 以雞骨素、半胱氨酸和葡萄糖等作為基本物質(zhì),通過(guò)查閱文獻(xiàn)[4,11-12]及預(yù)實(shí)驗(yàn)建立了一個(gè)熱反應(yīng)體系:在100 g體系中,VB1、甘氨酸、丙氨酸、I+G、L-半胱氨酸各1 g,葡萄糖2 g,木糖2.5 g,HVP 10 g,蒸餾水20 g,清湯型和白湯型雞骨素美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(清湯MRPs1和白湯MRPs1)及雞骨素酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(清湯MRPs2和白湯MRPs2)分別加入80 g未酶解骨素和骨素酶解液,在滅菌鍋中110 ℃反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后,立刻將反應(yīng)產(chǎn)物移出,靜置1 d后,將清湯MRPs1、白湯MRPs1、清湯 MRPs2、白湯MRPs2,進(jìn)行感官評(píng)價(jià),并對(duì)其揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行分析。

1.2.3 感官分析 來(lái)自北京工商大學(xué)分子感官科學(xué)實(shí)驗(yàn)室的9名有經(jīng)驗(yàn)的成員(5女4男,年齡20～30歲)組成感官鑒評(píng)小組,對(duì)4種樣品進(jìn)行描述性風(fēng)味感官鑒評(píng)并打分。感官鑒評(píng)分別從氣味、滋味2個(gè)方面對(duì)樣品進(jìn)行綜合風(fēng)味感官評(píng)價(jià),樣品用蒸餾水稀釋50倍,用水浴鍋調(diào)整樣品溫度至37 ℃,品評(píng)員對(duì)樣品進(jìn)行品評(píng)。感官指標(biāo)的評(píng)分采用10分制,從0分(未感知)至10分(特別強(qiáng)烈)氣味強(qiáng)度逐漸增加。

1.2.4 風(fēng)味物質(zhì)提取方法 采用手動(dòng)固相微萃取(solid-phase microextraction,SPME)技術(shù)對(duì)MRPs1、MRPs2的揮發(fā)性香氣化合物進(jìn)行提取。在40 mL頂空瓶中分別加入10 mL樣品、1 μL濃度為0.816 μg/μL的內(nèi)標(biāo)物2-甲基-3-庚酮溶液,混勻后密封。將樣品置于60 ℃水浴中平衡20 min,插入固相微萃取纖維頭(DVB/CAR on PDMS),頂空吸附40 min。萃取結(jié)束后立即將萃取頭插入氣相色譜儀進(jìn)樣口中,于250 ℃條件下解析5 min進(jìn)樣。每個(gè)樣品在相同提取與檢測(cè)條件下重復(fù)做3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜儀條件餾分分離 采用DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)和DB-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細(xì)管柱。升溫程序:初始溫度40 ℃保持3 min,以5 ℃/min 升溫到200 ℃,保持0 min,再以10 ℃/min 升溫到230 ℃,保持3 min,檢測(cè)過(guò)程共41 min。氣相色譜使用的載氣為氦氣;流速為1.2 mL/min;分流比1∶1。質(zhì)譜條件:電子轟擊(electron impact,EI)離子源,電子能量-70 eV,傳輸線溫度280 ℃,離子源溫度為230 ℃,四極桿溫度為150 ℃,質(zhì)量掃描范圍m/z 35～350。

1.2.6 揮發(fā)性香氣化合物的定性和定量分析 采用保留指數(shù)(retention index,RI)、NIST14譜庫(kù)質(zhì)譜檢索以及對(duì)比嗅聞數(shù)據(jù)3種方法對(duì)未知揮發(fā)性香氣化合物進(jìn)行鑒定。揮發(fā)性香氣化合物的RI值利用正構(gòu)系列烷烴進(jìn)行換算,計(jì)算公式為:

RI=100N+100n(tRa-tRN)/(tR(N+n)-tRN)

式中:N為待測(cè)香氣化合物a左側(cè)低碳數(shù)烷烴的碳數(shù);n為a兩側(cè)的兩個(gè)烷烴之間相差的碳數(shù);tR為相應(yīng)化合物的保留時(shí)間。

由于本實(shí)驗(yàn)只需對(duì)比定量,因此采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行半定量分析。每種化合物的濃度計(jì)算公式為:

Ci=Cis×Aj/Ais

式中:Ci為化合物濃度(μg/mL);Cis為內(nèi)標(biāo)濃度(μg/mL);Aj為化合物的色譜峰面積;Ais為內(nèi)標(biāo)物的色譜峰面積。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Microsoft Excel 2007數(shù)據(jù)處理軟件處理數(shù)據(jù)及SPSS 11對(duì)結(jié)果進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官評(píng)價(jià)

對(duì)4種雞骨素美拉德反應(yīng)香精進(jìn)行感官評(píng)價(jià),在氣味方面,MRPs1的油脂味、異味、硫臭味均高于MRPs2,而烤香、雞肉味、焦糖味均低于MRPs2。在滋味方面,MRPs1的焦糊味、油膩味較高,而鮮味、肉味、醇厚感、后味都明顯低于MRPs2。說(shuō)明無(wú)論是清湯型還是白湯型,酶解對(duì)其香氣滋味都有貢獻(xiàn),使反應(yīng)產(chǎn)物的味道更加濃郁圓潤(rùn)。與孫紅梅等[8-9]的研究結(jié)果類似,酶解處理增加了最終產(chǎn)物的烤香味、脂香味、肉香味,使整體風(fēng)味更加圓潤(rùn)、濃厚。

圖1 4種產(chǎn)物的氣味雷達(dá)圖Fig.1 Radar character of volatile flavor of four products

圖2 4種產(chǎn)物的滋味雷達(dá)圖Fig.2 Radar character of taste of four products

2.2 揮發(fā)性風(fēng)味成分的測(cè)定

通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,4種美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的揮發(fā)性風(fēng)味成分如表2所示,共鑒定出 70種化學(xué)成分,主要為醛酮類、醇類、酸類、酯類、雜環(huán)類化合物等。在清湯MRPs1鑒定出29種揮發(fā)性風(fēng)味成分,MRPs2鑒定出50種揮發(fā)性風(fēng)味成分;在白湯MRPs1鑒定出38種揮發(fā)性風(fēng)味成分,MRPs2鑒定出53種揮發(fā)性風(fēng)味成分。清湯MRPs2所得揮發(fā)性風(fēng)味成分比MRPs1多21種,其中雜環(huán)類的物質(zhì)濃度變化最為明顯,可能是清湯骨素蛋白含量較高,酶解后的游離氨基酸種類更加豐富。白湯MRPs2所得揮發(fā)性風(fēng)味成分比MRPs1多15種,酶解后醛類物質(zhì)相對(duì)含量減少,醇類物質(zhì)更加豐富,其他類均有變化,總體上MRPs2的香氣成分種類更加豐富,含量更高,可見(jiàn)酶解使香精味道更加濃郁飽滿。

表2 雞骨素及其酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物揮發(fā)性風(fēng)味成分的SPME/GC-O-MS分析Table 2 Volatile flavor compounds from MRPs1 and MRPs2 identified by SPME/GC-O-MS

續(xù)表

表3 雞骨素及其酶解液美拉德反應(yīng)香氣成分相對(duì)含量對(duì)比Table 3 Comparison of relative content of volatile flavor compounds identified in MRPs1 and MRPs2

醛、酮類揮發(fā)性物質(zhì)一般由脂肪酸降解產(chǎn)生[15]。清湯MRPs2檢測(cè)到11種醛,相對(duì)含量33.23%,MRPs1檢測(cè)到9種醛,相對(duì)含量39.98%;白湯MRPs2檢測(cè)到18種醛,相對(duì)含量60.82%,MRPs1檢測(cè)到13種醛,相對(duì)含量27.65%。兩種雞肉香精酶解之后醛類物質(zhì)增多,但相對(duì)含量減少,酶解液中醛類物質(zhì)含量減少可能是由于酶解的過(guò)程中雞脂氧化程度受到抑制[11]。而白湯骨素脂肪含量高,醛類物質(zhì)更加豐富。醛類物質(zhì)一般閾值較低,具有脂肪香味,是肉類的特征風(fēng)味物質(zhì)[16-17]。Farmer[18]報(bào)道,壬醛、反-2-壬烯醛、反,反-2,4-壬二烯醛、癸醛、反,反-2,4-癸二烯醛、2-十一烯醛等均是雞肉特征香味化合物。MRPs1中醛酮類物質(zhì)比MRPs2種類少,含量低;而2-甲基-2-丁烯醛、5-甲基呋喃醛、4-乙基苯甲醛、反-2-壬烯醛、2-十一碳烯醛則只出現(xiàn)在白湯MRPs2中,它們可能是賦予產(chǎn)品脂香風(fēng)味的主要香氣成分[19]。并且感官評(píng)價(jià)也證明白湯MRPs2具有濃厚的脂香味。研究表明,若從雞肉、雞湯萃取物中除去羰基化合物,會(huì)大大削弱萃取物的特征脂肪香(即雞香味),而醛類物質(zhì)閾值一般都低于其他羰基化合物,故其在雞肉香氣組成中占據(jù)重要的地位[20]。

揮發(fā)性化合物中的醇類可能來(lái)源于脂肪酸的氧化[21]。在醇類化合物中,直鏈飽和醇閾值較高,對(duì)風(fēng)味影響不大,但不飽和醇閾值較低,對(duì)風(fēng)味的形成有一定作用[22]。醇類化合物對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的總體氣味有協(xié)同效應(yīng)[23],例如,反應(yīng)產(chǎn)物中1-辛烯-3-醇具有蘑菇氣味。清湯MRPs1中檢測(cè)出醇類物質(zhì)3種,MRPs2中檢測(cè)出5種;白湯MRPs1中檢測(cè)出醇類物質(zhì)3種,MRPs2中檢測(cè)出4種,可見(jiàn)MRPs1的醇類物質(zhì)含量低于MRPs2。

酯類化合物中的內(nèi)酯和硫酯閾值較低,其它的酯類閾值較高,一般認(rèn)為對(duì)雞肉香氣無(wú)特殊貢獻(xiàn)。酯類物質(zhì)主要由脂肪氧化產(chǎn)生的醇和游離脂肪酸經(jīng)酯化反應(yīng)形成[24],C1～C10脂肪酸生成的酯具有典型的果香味,而長(zhǎng)鏈脂肪酸形成的長(zhǎng)鏈酯更多地表現(xiàn)出油脂味[25],能使香料整體風(fēng)味更濃厚、協(xié)調(diào)。與 MRPs1相比,MRPs2中酯類的濃度含量更高,氣味更加柔和。與清湯的相比,白湯中酯類的含量更高、種類更多,氣味更加濃郁。

酮類化合物的閾值一般較高,對(duì)雞肉特征風(fēng)味的貢獻(xiàn)較小,但有些是形成雜環(huán)化合物的重要中間體,對(duì)肉香形成起到不可忽視的作用[26-27]。清湯MRPs2中酮類物質(zhì)的濃度為53 ng/g,幾乎是MRPs1酮類物質(zhì)的濃度27 ng/g的2倍。在白湯的兩種產(chǎn)物中均發(fā)現(xiàn)具有植物芳香性的6-甲基-5-庚烯-2-酮,以及對(duì)香料的甜味和香味有強(qiáng)增效作用的3-羥基-2-甲基-4-吡喃酮,但是白湯MRPs2酮類物質(zhì)濃度更高。MRPs2 中的醛酮類物質(zhì)使肉味香料的風(fēng)味更加圓潤(rùn)、有層次感。Cross 等[28]證實(shí),醛酮類化合物對(duì)產(chǎn)品中肉香味的構(gòu)成起到不可替代的作用,從揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中除去羰基化合物后,肉品的特有風(fēng)味消失。

酸類物質(zhì)閾值較高,由醛酮類物質(zhì)氧化或脂肪酸降解產(chǎn)生,能夠有效地修飾風(fēng)味,乙酸在80%以上的香精樣品中均有檢出[29],MRPs2的酸類化合物的種類較豐富。

呋喃類化合物和酚類化合物被認(rèn)為是蒸煮雞肉的主要香氣成分[30-31]。烷基呋喃主要來(lái)源于不飽和脂肪酸的氧化,其中2-戊基呋喃主要來(lái)源于亞油酸或2-癸二烯醛的氧化,閾值較低,是肉品的重要風(fēng)味物質(zhì)[32,16]。MRPs2中呋喃類物質(zhì)的濃度更高,白湯MRPs2中的2-戊基呋喃達(dá)10 ng/g。天然愈創(chuàng)木酚是雞肉的特征香氣成分,在MRPs2中的濃度約是MRPs1的2倍。酚類的種類基本相同,但MRPs2中的濃度較高。

Maillard反應(yīng)產(chǎn)物中雜環(huán)化合物通常具有較低的閾值,多數(shù)具有烤肉香氣[33]。例如雜環(huán)化合物中具有堅(jiān)果味與烤香味的含氮吡嗪類化合物閾值較低,是揮發(fā)性風(fēng)味成分中的重要組分[34]。清湯MRPs2含有9類吡嗪,MRPs1中含有3類吡嗪,且吡嗪的種類和相對(duì)含量明顯少于MRPs2,感官評(píng)價(jià)中也能看出MRPs2的烤香味強(qiáng)度大于MRPs1。白湯MRPs2 含有5類吡嗪,MRPs1中含有3類吡嗪。除此之外,2,5-二甲基-3-乙基吡嗪、3,5-二甲基-2-乙基吡嗪、2-甲基-3,5-二乙基吡嗪、3,6-二甲基-2異戊基-吡嗪只在清湯中檢出,可能是因?yàn)檫@些雜環(huán)化合物來(lái)源于氨基酸和還原糖之間的美拉德反應(yīng),氨基酸(如脯氨酸)的熱解及硫胺素的熱解[35],而清湯骨素的蛋白含量較高。Maillard反應(yīng)產(chǎn)物中閾值較低的含硫化合物也是肉類風(fēng)味的重要來(lái)源[36],如4-甲基-5-羥乙基噻唑是已報(bào)道的對(duì)肉香風(fēng)味具有重要貢獻(xiàn)意義的雜環(huán)化合物[37]。

此外,本實(shí)驗(yàn)還檢出少量的烴類化合物,一般認(rèn)為對(duì)雞肉香氣無(wú)特殊貢獻(xiàn)。有些可能是形成雜環(huán)化合物的重要中間體,有助于提升整體風(fēng)味[38]。檢測(cè)到的4-烯丙基苯甲醚對(duì)熱反應(yīng)香精的整體風(fēng)味有一定作用,只在MRPs2中檢出。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用SPME提取揮發(fā)性風(fēng)味成分,用氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)無(wú)論是清湯骨素還是白湯骨素,酶解都可以增加骨抽提物中多肽及游離氨基酸的含量,使美拉德反應(yīng)得到的肉味香料風(fēng)味更加醇厚。與清湯MRPs2相比,白湯MRPs2的醛酮類物質(zhì)種類更多,反-2-壬烯醛、2-十一碳烯醛、反-2-癸烯醛、反,反-2,4-癸二烯醛、3-羥基-2-甲基-4-吡喃酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮等特征香氣成分只在白湯骨素中檢出,可能是因?yàn)榘诇撬刂竞扛?容易發(fā)生脂肪酸的降解和氧化,使體系內(nèi)揮發(fā)性肉香成分增加[39]。但是在雜環(huán)類物質(zhì)中清湯MRPs2則更加豐富,例如2-乙酰基呋喃、2,5-二甲基-3-乙基吡嗪、3,5-二甲基-2-乙基吡嗪、2-甲基-3,5-二乙基吡嗪、3,6-二甲基-2-異戊基吡嗪等則只在清湯骨素中檢出,這些物質(zhì)可能是由氨基酸和糖發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生的,對(duì)肉香味的形成起重要作用。由此可見(jiàn),脂肪和氨基酸都對(duì)肉香味的形成起到不可忽視的作用。