梁建慶，何建成

近年來，表觀遺傳修飾在許多重大疾病致病機(jī)制中的作用受到廣泛關(guān)注[1]。在表觀遺傳修飾中，DNA甲基化水平的高低可能對(duì)疾病產(chǎn)生影響。因此，探討DNA甲基化與疾病的關(guān)系[2-4]，更深入地研究疾病的致病機(jī)制，可為疾病的預(yù)防、診斷和治療提供新途徑[5]。胡雅岑等[6]構(gòu)建了1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)小鼠帕金森病(Parkinson's disease，PD)模型，并進(jìn)一步證實(shí)DNA甲基化修飾異常在PD發(fā)病機(jī)制中起重要作用，環(huán)境因素(如MPTP)可以通過改變DNA甲基化修飾參與PD的發(fā)生發(fā)展。本研究構(gòu)建6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)大鼠PD模型，探討大鼠黑質(zhì)及紋狀體中DNA甲基化水平，以揭示甲基化與PD發(fā)病的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 大鼠腦立體定位儀(RWD-68003型)購(gòu)自深圳瑞沃德生命科技有限公司；高效液相色譜儀(1200 Series)購(gòu)自美國(guó)Agilent Technologies公司；色譜柱(4.6mm×150.0mm，5μm，518935-902)購(gòu)自美國(guó)Agilent公司；高速冷凍離心機(jī)(Multifuge IS-R)購(gòu)自德國(guó)Thermo公司；超聲破碎儀(XL 2000)購(gòu)自美國(guó)Misonix公司；漩渦混勻器(XW-80A)購(gòu)自上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠。

1.2 藥物與試劑 6-OHDA(批號(hào)：MKBP0832V)、阿撲嗎啡(apomorphine，APO，批號(hào)：SLBF6369V)、抗壞血酸(批號(hào)：063K1082)、胞嘧啶(cytosine，C，批號(hào)：C500060)、5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5-mC，批號(hào)：Lot#1451791V)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；戊巴比妥鈉(批號(hào)：WS20130112)購(gòu)自上海中西藥業(yè)股份有限公司；慶大霉素(0.3g/支，批號(hào)：20130675)購(gòu)自上海第一制藥廠；UNIQ-10柱動(dòng)物基因組DNA分離試劑盒(批號(hào)：B511206)購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；甲基亮氨酸通用甲基化試劑盒(批號(hào)：P-1011-2)購(gòu)自美國(guó)Epigentek公司；抗-Dnmt1抗體(批號(hào)：ab13537)、抗-Dnmt3a抗體(批號(hào)：ab2850)、抗-Dnmt3b抗體(批號(hào)：ab13604)均購(gòu)自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 30只SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重180～200g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào)：SYXK(滬)2012-0002]。動(dòng)物飼養(yǎng)在上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，恒溫(23±2)℃，自動(dòng)光-暗控制(12h:12h，即7:00-19:00光照，19:00-7:00暗置)，相對(duì)濕度60%～65%，大鼠自由攝食、飲水。將30只SD大鼠分為模型組(Model組)、正常組(NC組)、假手術(shù)組(SO組)，每組10只。

1.4 大鼠模型制備 SD大鼠的PD模型構(gòu)建采用Ungerstedt等[7]建立并經(jīng)過本課題組探索、反復(fù)驗(yàn)證的兩點(diǎn)法進(jìn)行制備[8-9]。造模前常規(guī)進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)測(cè)試，確認(rèn)大鼠無異常旋轉(zhuǎn)行為后，采用3%戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射麻醉，剪去顱頂鼠毛，暴露頭部皮膚，將其正確固定在大鼠腦立體定位儀上，用1%濃度碘伏溶液在大鼠顱頂部手術(shù)區(qū)域常規(guī)消毒；在無菌條件下用手術(shù)刀沿正中線切開大鼠顱頂部皮膚，剝離骨膜，充分暴露前囟和后囟，保證大鼠前囟和后囟在同一水平線上。根據(jù)包新民等[10]編著的大鼠腦立體定位圖譜，以前囟為準(zhǔn)，確定右側(cè)黑質(zhì)兩點(diǎn)坐標(biāo)：①前囟后5.2mm，正中線右側(cè)1.0mm，硬膜下9.0mm；②前囟后5.2mm，正中線右側(cè)2.5mm，硬膜下8.5mm。使用顱骨鉆小心鉆開顱骨，用5μl微量進(jìn)樣器將6-OHDA(溶于含0.2%維生素C的超純水中，即將抗壞血酸0.001g溶于超純水0.5ml中)先后分別注入(以1.0mm/min速度緩慢進(jìn)針，注射速度為1μl/min)右側(cè)黑質(zhì)兩點(diǎn)處，每孔3μl，注射完畢后留針5min，以1.0mm/min速度緩慢退針。手術(shù)完畢后，用醫(yī)用明膠海綿填塞顱骨孔，仔細(xì)縫合切口處骨膜及皮膚，肌內(nèi)注射慶大霉素7d，待動(dòng)物蘇醒后放回籠中飼養(yǎng)。假手術(shù)組只注射含0.2%維生素C的超純水，正常對(duì)照組只捆綁動(dòng)物，不做任何處理。造模10d后，以腹腔注射0.5mg/kg APO誘發(fā)大鼠向健側(cè)旋轉(zhuǎn)，記錄開始旋轉(zhuǎn)至30min內(nèi)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，以旋轉(zhuǎn)圈數(shù)平均＞7次/min者為合格的動(dòng)物模型[11]。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 大鼠全基因組甲基化水平檢測(cè) 摘取大鼠黑質(zhì)及紋狀體組織，采用ELISA法測(cè)定大鼠全基因組甲基化水平，取大鼠黑質(zhì)及紋狀體置于EP管中，用UNIQ-10柱動(dòng)物基因組DNA分離試劑盒提取大鼠黑質(zhì)及紋狀體組織DNA，甲基亮氨酸通用甲基化試劑盒測(cè)定大鼠全基因組甲基化率。

1.5.2 大鼠黑質(zhì)及紋狀體組織胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶的含量檢測(cè) 采用HPLC法檢測(cè)大鼠黑質(zhì)及紋狀體組織胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶的含量。色譜條件：色譜柱Agilent，150.0mm×4.6mm，粒徑5μm。流動(dòng)相(新鮮配制并經(jīng)0.45μm的濾膜過濾)為0.045mol/L無水檸檬酸，0.19mol/L無水乙酸鈉，0.43mmol/L辛烷基磺酸鈉，0.23mmol/L乙二胺四乙酸，體積分?jǐn)?shù)為0.08的甲醇，pH值4.6，流量1.0ml/min，柱溫25℃，檢測(cè)器工作電位0.48V，靈敏度1μA。

1.5.3 大鼠黑質(zhì)及紋狀體組織Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用Western blotting法檢測(cè)大鼠黑質(zhì)及紋狀體組織Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b蛋白表達(dá)，采用AlphaView圖像分析軟件對(duì)掃描圖像的目標(biāo)條帶進(jìn)行灰度分析，各目的條帶與β-actin的灰度比值為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5.4 大鼠黑質(zhì)-紋狀體全基因組差異甲基化圖譜繪制 采用上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司的MethylRAD技術(shù)進(jìn)行大鼠黑質(zhì)-紋狀體全基因組差異甲基化圖譜繪制。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有資料均以表示，方差齊性檢驗(yàn)后再進(jìn)行單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠全基因組甲基化的比較 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常組及假手術(shù)組比較，模型組大鼠黑質(zhì)及紋狀體中DNA總體甲基化水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，表1)。

表1 大鼠全基因組甲基化率比較(%，±s，n=10)Tab.1 Comparison of the whole genome methylation rate in rats (%,±s,n=10)

表1 大鼠全基因組甲基化率比較(%，±s，n=10)Tab.1 Comparison of the whole genome methylation rate in rats (%,±s,n=10)

(1)P＜0.01 compared with normal control group; (2)P＜0.01 compared with sham operation group

Striatum methylation rate Normal control 7.14±0.54 9.13±0.69 Sham operation 6.95±0.57 8.99±0.64 Model 4.53±0.58(1)(2) 6.42±0.61(1)(2)Group Substantia nigra methylation rate

2.2 大鼠胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶的表達(dá)變化 與正常組及假手術(shù)組比較，模型組大鼠黑質(zhì)及紋狀體中胞嘧啶明顯升高，5-甲基胞嘧啶明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，圖1、表2)。

圖1 大鼠胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶色譜圖Fig.1 Chromatogram of cytosine and 5- methylcytosine in ratsC.Cytosine; 5-mC.5-methylcytosine; A.Control article; B.Trial product

表2 各組大鼠胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶的比較(μg/g，±s，n=10)Tab.2 Comparison of cytosine and 5-methylcytosine in rats of each group (μg/g,±s,n=10)

表2 各組大鼠胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶的比較(μg/g，±s，n=10)Tab.2 Comparison of cytosine and 5-methylcytosine in rats of each group (μg/g,±s,n=10)

C.Cytosine; 5-mC.5-methylcytosine; (1)P＜0.01 compared with normal control group; (2)P＜0.01 compared with sham operation group

5-mC C 5-mC Normal control 4.16±0.37 4.15±0.36 11.15±0.23 11.29±0.23 Sham operation 4.13±0.32 4.20±0.34 11.23±0.21 11.21±0.25 Model 6.94±0.16(1)(2) 1.95±0.13(1)(2) 19.86±0.62(1)(2) 3.19±0.31(1)(2)Group Substantia nigra Striatum C

2.3 大鼠Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b蛋白的表達(dá)變化 Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常組及假手術(shù)組比較，模型組大鼠黑質(zhì)及紋狀體中Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b蛋白的表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，圖2、3，表3)。

圖2 各組大鼠黑質(zhì)(A)及紋狀體(B)中Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b蛋白表達(dá)Fig.2 Expression of Dnmt1,Dnmt3a and Dnmt3b proteins in substantia nigra (A) and striatum (B) of ratsNC.Normal control; SO.Sham operation

表3 各組大鼠黑質(zhì)及紋狀體Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b蛋白表達(dá)比較(/β-actin，±s，n=10)Tab.3 Changes of protein expression of Dnmt1,Dnmt3a and Dnmt3b in rats (/β-actin,±s,n=10)

表3 各組大鼠黑質(zhì)及紋狀體Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b蛋白表達(dá)比較(/β-actin，±s，n=10)Tab.3 Changes of protein expression of Dnmt1,Dnmt3a and Dnmt3b in rats (/β-actin,±s,n=10)

(1)P＜0.01 compared with normal control group; (2)P＜0.01 compared with sham operation group

Group Substantia nigra Striatum Dnmt1 Dnmt3a Dnmt3b Dnmt1 Dnmt3a Dnmt3b Normal control 0.15±0.03 0.18±0.03 0.67±0.04 1.15±0.14 1.19±0.13 1.66±0.14 Sham operation 0.13±0.02 0.22±0.04 0.74±0.03 1.13±0.11 1.21±0.12 1.76±0.11 Model 1.96±0.12(1) 1.97±0.11(1)(2) 1.89±0.13(1)(2) 3.86±0.42(1)(2) 3.69±0.31(1)(2) 3.85±0.36(1)(2)

2.4 大鼠全基因組差異甲基化圖譜 從染色體圖譜來看，差異甲基化位點(diǎn)在染色體上的分布是不均勻的，將差異位點(diǎn)在染色體上標(biāo)識(shí)如下圖(圖3)。

圖3 各組大鼠黑質(zhì)(A)及紋狀體(B)的差異甲基化圖譜Fig.3 Differential methylation atlas of substantia nigra (A) and striatum (B) in normal control group,sham operation group and model group

3 討 論

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分，是在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5'-端的胞嘧啶(C)轉(zhuǎn)變?yōu)?'-甲基胞嘧啶(5mC)的過程。DNA甲基化可以發(fā)生在腺嘌呤的N-6位、鳥嘌呤的N-7位、胞嘧啶的C-5位等。但在哺乳動(dòng)物中DNA甲基化主要發(fā)生在5'-CpG-3'的胞嘧啶上生成5-甲基胞嘧啶。在哺乳動(dòng)物中CpG以兩種形式存在：一種分散于DNA序列中；另一種呈現(xiàn)高度聚集狀態(tài)，人們稱之為CpG島。在正常組織里，70%～90%散在的CpG是被甲基修飾的，而CpG島則往往是非甲基化的(某些特殊區(qū)段和基因除外)。正常情況下，人類基因組“垃圾”序列的CpG二核苷酸相對(duì)稀少，并且總是處于甲基化狀態(tài)，與之相反，人類基因組中大小為100～1000bp的富含CpG二核苷酸的CpG島則總是處于未甲基化狀態(tài)，并且CpG島常位于轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)附近，與56%的人類基因組編碼基因相關(guān)，因此基因轉(zhuǎn)錄區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)的研究就顯得十分重要[12]。DNA甲基化在維持正常細(xì)胞功能、遺傳印記中起著重要作用，是目前新的研究熱點(diǎn)之一。DNA甲基化能關(guān)閉某些基因的活性，去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達(dá)。DNA甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)。機(jī)體處于甲基化平衡狀態(tài)是基因表達(dá)的合理調(diào)控及遺傳物質(zhì)保持穩(wěn)定的必要保障[13]。Dnmts主要有3種：Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b。Dnmt1在細(xì)胞分裂中起穩(wěn)定的、最主要的、維持甲基化狀態(tài)的作用。Dnmt3a與Dnmt3b均為重頭甲基轉(zhuǎn)移酶，參與DNA甲基化的從頭合成。由此可見，DNA甲基化是由Dnmts來催化和維持的。可見Dnmts調(diào)控DNA的甲基化水平，從而達(dá)到調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用[14]。

PD是一種常見的中老年人神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，臨床主要表現(xiàn)是震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)減少和姿勢(shì)異常[15]。PD的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，與氧化應(yīng)激、神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及受體、TH(酪氨酸羥化酶)等因素有關(guān)。目前，DNA甲基化與PD發(fā)病機(jī)制關(guān)系的研究已經(jīng)起步，但研究成果不多，結(jié)果存在矛盾之處[6]。Lee等[16]以及Charlton等[17]將內(nèi)源性甲基供體S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)注入嚙齒類動(dòng)物腦內(nèi)可導(dǎo)致PD樣改變，提示過度甲基化可能為PD的誘發(fā)因素，Obeid等[18]發(fā)現(xiàn)PD患者外周血中SAM相對(duì)含量下降。Pieper等[19]發(fā)現(xiàn)，PD患者黑質(zhì)致密部細(xì)胞中的TNF-α啟動(dòng)子甲基化水平明顯降低，SNCA基因內(nèi)含子1甲基化水平明顯降低，提示低甲基化可能與PD發(fā)病相關(guān)。因此，本研究致力于從基因組水平對(duì)PD的DNA甲基化進(jìn)行全面探索研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組及假手術(shù)組比較，模型組大鼠黑質(zhì)及紋狀體中DNA總體甲基化水平均明顯降低，胞嘧啶升高、5-甲基胞嘧啶明顯降低，Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b蛋白的表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；從染色體圖譜來看，模型組大鼠黑質(zhì)及紋狀體差異甲基化位點(diǎn)在染色體上的分布是不均勻的。研究結(jié)果提示DNA低甲基化修飾在PD發(fā)病中有一定作用。

綜上，模型組大鼠全基因組DNA甲基化水平普遍降低，揭示低甲基化與PD的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，下一步應(yīng)探索模型組大鼠1st exon(第一個(gè)外顯子)、Body(基因區(qū))、TSS200(基因起始位點(diǎn)上游200bp內(nèi)的區(qū)域)、TSS1500(基因起始位點(diǎn)上游1500bp內(nèi)200bp外的區(qū)域)、intron(內(nèi)含子區(qū))、intergenic(基因間區(qū))等甲基化位點(diǎn)在基因組不同功能元件上的分布，以進(jìn)一步明確甲基化與PD發(fā)病機(jī)制的關(guān)系。