曾婷婷，譚立明，田永建，余建林，吳洋，蔣永清

類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種臨床常見的自身免疫性疾病，以小關(guān)節(jié)滑膜炎癥起病，病因尚未明確[1]。RA病程進展到后期可導致局部或全身性骨質(zhì)破壞?；颊叱霈F(xiàn)關(guān)節(jié)功能損傷或骨質(zhì)疏松等并發(fā)癥[2]。14-3-3η蛋白已被報道在RA患者血清中水平升高，且與RA骨質(zhì)破壞相關(guān)[3-4]，但其具體機制尚未闡明。本研究通過測定血清14-3-3η、類風濕因子(rheumatoid factor，RF)、抗環(huán)瓜氨酸多肽抗體(anti-cyclic citrulline polypeptide antibody，anti-CCP)及骨代謝相關(guān)指標水平，評估14-3-3η對RA的臨床診斷價值，并分析其與RA患者骨代謝指標的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 納入2016年9月－2017年12月南昌大學第二附屬醫(yī)院收治的113例RA、40例骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)和37例強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)患者以及該院同期健康體檢者77例。RA患者為RA組，診斷符合2010年美國風濕病學會(American College of Rheumatology，ACR)/歐洲抗風濕聯(lián)盟(The European League Against Rheumatism，EULAR)RA診斷及分類標準[5]。OA及AS患者為非RA(non-RA)組，患者診斷均符合相關(guān)指南[6-7]，并伴有明顯小關(guān)節(jié)痛。77例健康體檢患者為健康對照組。受試者血清標本由南昌大學第二附屬醫(yī)院生物樣本庫提供。所有標本均在患者知情條件下獲得，并經(jīng)南昌大學第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準許可。

1.2 納入及排除標準 符合條件者予以納入：①自愿參與研究，簽署知情同意書；②臨床診斷明確，臨床資料翔實；③OA及AS患者有明顯的小關(guān)節(jié)疼痛表現(xiàn)；④資料經(jīng)重新評估，不合并其他自身免疫性疾病、骨質(zhì)疏松和(或)骨腫瘤等系統(tǒng)性骨病及其他各系統(tǒng)嚴重合并癥；⑤采血前2個月內(nèi)未發(fā)生骨折及服用各種影響骨代謝指標檢測的藥物；⑥健康體檢者各項常規(guī)指標檢測無異常。排除標準：①合并嚴重的肝、腎、心或肺等系統(tǒng)疾病，內(nèi)分泌或免疫系統(tǒng)紊亂；②妊娠或哺乳期婦女及生長發(fā)育期兒童。

1.3 試劑及方法 患者資料由南昌大學第二附屬醫(yī)院病例系統(tǒng)收集，包括患者性別、年齡、病程、晨僵時間、壓痛和(或)腫脹關(guān)節(jié)數(shù)量、C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)及紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)檢查結(jié)果等。采用ELISA檢測所有研究對象血清14-3-3η蛋白及anti-CCP水平，試劑分別購自武漢華美生物工程有限公司(武漢，中國)和科新生物科技股份有限公司(上海，中國)。血清RF水平通過速率散射比濁法測定，采用的IMMAGE 800全自動特定蛋白分析系統(tǒng)及配套試劑購自美國貝克曼庫爾特有限公司。RA患者血清骨鈣素(osteocalcin，OC)、25羥維生素D[25-hydroxy vitamin D，25-(OH)D]、甲狀旁腺素(parathyroid hormone，PTH)、Ⅰ型膠原氨基端前肽(aminoterminal propeptide of type I collagen，PINP)和β-膠原降解產(chǎn)物(β-crosslaps，β-CTx)采用cobas e601全自動電化學發(fā)光儀及配套試劑檢測，儀器及試劑購自羅氏診斷產(chǎn)品有限公司(上海，中國)。骨堿性磷酸酶通過凝集素親合法手工測定，試劑由中生金域診斷技術(shù)有限公司(北京，中國)提供。實驗室檢測操作均嚴格遵照所用試劑操作說明書及南昌大學第二附屬醫(yī)院標準作業(yè)程序(SOP)文件進行，所有標本重復檢測2次，批間及批內(nèi)誤差均＜5%。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用Kolmogorov-Smirnov檢驗和Levene's檢驗分析計量資料數(shù)據(jù)正態(tài)性和方差齊性；正態(tài)分布資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；偏態(tài)分布以[M(Q)]表示，組間水平差異采用非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗，進一步兩兩比較采用Nemenyi檢驗；繪制受試者工作曲線(ROC)，通過曲線下面積(AUC)評估并比較各指標診斷RA的價值，通過logistic回歸模型建立2個或多個指標聯(lián)合，比較診斷價值；各實驗室檢測指標間相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 受試對象人口學特征及實驗室檢測結(jié)果的比較 所有研究對象人口學特征及血清RF、anti-CCP和14-3-3η檢測結(jié)果如表1所示。各組性別及年齡差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。經(jīng)Kruskal-Wallis及事后Nemenyi檢驗分析，RA組血清RF、anti-CCP和14-3-3η水平明顯高于non-RA組和健康對照組(P＜0.01)，且non-RA組RF和14-3-3η水平明顯高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

2.2 14-3-3η單獨或聯(lián)合RF和(或)anti-CCP對RA的診斷價值 ROC曲線結(jié)果分析顯示，14-3-3η、RF和anti-CCP診斷RA的AUC分別為0.845，0.807和0.878，3個指標兩兩聯(lián)合或3個指標聯(lián)合可提高診斷價值(圖1)。在2.60ng/ml截斷點時，14-3-3η診斷RA的敏感性和特異性分別為62.83%和92.21%。

2.3 不同14-3-3η水平組RA患者實驗室檢查結(jié)果比較 根據(jù)ROC曲線分析結(jié)果，選取2.6ng/ml為截斷點將RA患者根據(jù)血清14-3-3η水平分為3組：＜2.6ng/ml組(n=43)，2.6～5.0ng/ml組(n=43)和＞5.0ng/ml組(n=27)。結(jié)果顯示，3組RA患者RF、anti-CCP、CRP、ESR、28關(guān)節(jié)活動度評分(28 joint disease activity score，DAS28)及PINP、β-CTx和OC等骨代謝指標中僅PINP和β-CTx在3組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，表2)。

2.4 RA患者實驗室檢測指標相關(guān)性分析 對113例RA患者所有實驗室檢測指標進行Pearson相關(guān)性分析，血清RF水平與anti-CCP水平相關(guān)系數(shù)(r)為0.732(P＜0.001)，14-3-3η與PINP及β-CTx強相關(guān)，r分別為0.817和0.808(P＜0.001，表3)。

表1 各組受試對象人口學特征及實驗室檢測結(jié)果比較Tab.1 Demographics and laboratory results of subjects in each group

圖1 14-3-3η、RF、anti-CCP及其聯(lián)合診斷RA的ROC曲線Fig.1 ROC curve of 14-3-3η,Rheumatoid facto,anti-CCP and their combination for Rheumatoid arthritis diagnosis AUC.Area under curve; RF.Rheumatoid factor; anti-CCP.Anti-cyclic citrulline polypeptide antibody

表2 不同14-3-3η水平組RA患者血清檢測結(jié)果比較Tab.2 Comparison of serum test results among RA patients with different serum levels of 14-3-3η protein

表3 RA患者血清學指標相關(guān)性分析(r)Tab.3 Correlation analysis of serum indices in patients with RA (r)

3 討 論

RA疾病管理的關(guān)鍵在于早期診斷并及時進行合理治療，延緩疾病進程[8]。目前，影像學檢查及血清學檢測RF和anti-CCP結(jié)合臨床表現(xiàn)是臨床診斷RA的主要手段[9]，但仍有部分癥狀不典型及血清學陰性的患者由于誤診或漏診而延誤治療[1]。14-3-3η已被證實在RA患者血清和關(guān)節(jié)滑液中明顯升高，對其診斷及鑒別診斷具有一定價值。Maksymowych等[10]的一項研究發(fā)現(xiàn)，血清14-3-3η水平(ng/ml)在早期RA組(0.76ng/ml)和非早期RA組(1.12ng/ml)均明顯高于健康人群(0.00ng/ml)和疾病對照組(0.02ng/ml)。ROC曲線分析結(jié)果顯示，選取≥0.19ng/ml為截斷點時，非早期RA組與健康對照相比，AUC為0.89(95%CI 0.85～0.93)，敏感性和特異性分別為77.0%和92.6%，將非早期RA患者與所有對照人群(健康人群及疾病對照人群)對比，14-3-3η診斷RA的敏感性和特異性分別為77.4%和86.0%。本研究結(jié)果顯示，血清14-3-3η蛋白水平在RA組(3.26ng/ml)明顯升高(P＜0.05)，且非RA組(1.84ng/ml)也明顯高于健康對照組(0.27ng/ml)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。說明炎性關(guān)節(jié)病變尤其是RA患者血清14-3-3η蛋白水平確有升高，可能與疾病的發(fā)生有關(guān)；經(jīng)ROC曲線分析，14-3-3η診斷RA的AUC為0.845(0.797～0.893)，診斷價值高于RF[0.807(0.751～0.862)]，而略低于anti-CCP[(0.878(0.830～0.926)]。當截斷值為2.60ng/ml時，14-3-3η對RA診斷的敏感性和特異性分別為62.83%和92.21%。以上結(jié)論與國內(nèi)外研究結(jié)論基本一致[10-12]，血清14-3-3η水平略有差異，可能由試劑盒差異所致。RF和anti-CCP是臨床常用于RA診斷和分類的生物標記物。本研究隨后評估了聯(lián)合14-3-3η、RF和(或)anti-CCP后對RA的診斷價值。結(jié)果顯示，3項指標兩兩聯(lián)合或3者聯(lián)合后診斷RA的AUC均變大，3項指標聯(lián)合后AUC最大為0.907，而14-3-3η聯(lián)合anti-CCP的AUC甚至超過臨床常用的RF與anti-CCP聯(lián)合(0.900vs.0.875)，與Maksymowych等[10]的結(jié)論基本一致。Carrier等[13]的研究表明，高水平14-3-3η聯(lián)合自身抗體陽性結(jié)果能夠增加RA的檢出率，該研究中增加的24例至少一項指標陽性的患者中，有20例雖然自身抗體檢測結(jié)果為陰性，但是已經(jīng)達到1978或2010年制定的RA診斷與分類標準，說明14-3-3η蛋白水平對RA患者的診斷確實具有一定的價值，尤其可以減少血清學陰性患者的漏診和誤診。

RA通常表現(xiàn)為對稱性小關(guān)節(jié)慢性炎癥，隨著疾病進展突破關(guān)節(jié)滑膜、侵蝕關(guān)節(jié)軟骨及骨質(zhì)，患者晚期可出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形和功能受損[14]。此外，RA還是發(fā)生繼發(fā)性骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)的重要原因[15-16]，發(fā)展為OP的RA患者極易發(fā)生骨折甚至導致患者殘疾[17]。14-3-3蛋白是一個高度保守的酸性蛋白家族，結(jié)構(gòu)上的兩性凹槽使得該蛋白能與胞內(nèi)200多種配體蛋白結(jié)合[18-19]，在多種生命活動調(diào)節(jié)和疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，功能涉及細胞周期調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導、生長與黏附、凋亡、免疫炎癥、腫瘤發(fā)生等。本研究通過對比不同14-3-3η蛋白濃度RA患者的骨代謝指標水平探討14-3-3η與RA患者骨代謝水平的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PINP和β-CTx在高14-3-3η組明顯高于低水平組，且經(jīng)Pearson相關(guān)分析PINP和β-CTx與14-3-3η高度相關(guān)(r分別為0.817和0.808)。PINP和β-CTx是常用的骨代謝指標，用于指示機體骨質(zhì)破壞及修復狀態(tài)[20-21]。PINP是膠原合成及轉(zhuǎn)化過程中前膠原分子氨基末端分解產(chǎn)物，能反映Ⅰ型膠原代謝狀態(tài)；而β-CTx是Ⅰ型膠原分解產(chǎn)物，是反映骨吸收的重要標志物，提示14-3-3η可能與RA患者骨代謝狀態(tài)相關(guān)，高14-3-3η蛋白水平患者可能更易發(fā)生骨代謝紊亂和骨質(zhì)疏松。Maksymowych等[4]研究證實14-3-3η能劑量依賴性地誘導與RA直接相關(guān)的炎性因子如：白介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-1、MMP-9和核因子-κB受體活化因子配基(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)的表達，且與RA關(guān)節(jié)損傷有關(guān)，但其具體機制未知。此外，多種MMPs已經(jīng)被證實參與關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)降解和關(guān)節(jié)軟骨及骨質(zhì)退變，進而參與如OA和RA等多種疾病的發(fā)生發(fā)展[22-23]。以上證據(jù)表明14-3-3η可能通過誘導MMPs高表達進而降解膠原成分，對關(guān)節(jié)軟骨及骨質(zhì)造成損傷，甚至改變患者全身骨代謝狀態(tài)，而其具體機制尚待進一步研究證實。CRP、ESR及DAS28是反映RA患者疾病活動度的常用指標，本研究未發(fā)現(xiàn)14-3-3η水平與三者相關(guān)，提示14-3-3η可能不是反映疾病活動度的良好指標。

綜上所述，血清14-3-3η蛋白檢測對RA的診斷鑒別具有臨床價值，并且聯(lián)合RF和(或)anti-CCP檢測可提高RA診斷效能。此外，14-3-3η蛋白血清水平與RA患者骨代謝水平存在關(guān)聯(lián)，可作為RA輔助診斷和病情監(jiān)測的參考指標。