程英雄，羅毅文，王 斌，胡年宏，譚瑞芬，吳志方，羅 輝，沈 瑋

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬骨傷科醫(yī)院，廣州 510240)

骨質(zhì)疏松癥是一種退化性疾病，中老年人隨著年齡的增大，骨質(zhì)疏松的發(fā)病率逐漸升高，由于骨骼脆性增加，老年人極易發(fā)生骨折[1]。中醫(yī)所述“腎藏精，精生髓，髓養(yǎng)骨”。腎精與骨髓是密不可分的共同體。中醫(yī)、中藥常采用補(bǔ)腎活血湯來促進(jìn)疏松性骨折的愈合。補(bǔ)腎活血湯出自清·趙竹泉《傷科大成》，是補(bǔ)腎活血法的代表方之一。前期研究表明，補(bǔ)腎活血湯能夠有效縮短骨折愈合時(shí)間，改善腕關(guān)節(jié)功能，并可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)BMSCs成骨分化。在調(diào)控BMSCs成骨分化過程的眾多通路中，Runx2與Osterix是決定成骨細(xì)胞分化的2個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子[2-3]。Osterix基因在2002年被Kazuhisa在誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過程中分離出來，骨膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨細(xì)胞都表達(dá)Osterix。Osterix位于成骨細(xì)胞分化路徑中Runx2的下游，并且Runx2為Osterix表達(dá)所必須[4]。Runx2和Osterix基因缺失可完全抑制成骨細(xì)胞分化[5]。本文旨在通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方法，探究補(bǔ)腎活血湯對(duì)Runx2和Osterix的影響，以此闡明補(bǔ)腎活血湯促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和骨骼愈合的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料及動(dòng)物

補(bǔ)腎活血湯組成：熟地黃18 g，菟絲子18 g，杜仲6 g，肉蓯蓉6 g，枸杞子6 g，補(bǔ)骨脂18 g，山萸肉6 g，獨(dú)活 6 g，當(dāng)歸6 g，紅花3 g，沒藥6 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥房提供。上述藥材共99 g，按照傳統(tǒng)煎煮方法，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至生藥含量0.9 g/L。間充質(zhì)干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室凍存，用時(shí)復(fù)蘇。Runx2慢病毒載體及高滴度含目的基因的慢病毒由北京利科麗生物提供；RNA提取試劑盒RNAiso Plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit、real-time PCR試劑盒SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(Takara，日本)；PCR引物由上海生工工程有限公司提供；BCIP/NBT堿性磷酸酶試劑盒(Beyotime，上海)； BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒(賽默飛，美國)； DMEM培養(yǎng)液(Gibco，美國)；FBS(Gibco，美國)；青霉素、鏈霉素(Sigma，美國)；Runx2多克隆抗體、Osterix多克隆抗體(Abcam，英國)；山羊抗兔二抗(Pierce，美國)；酶標(biāo)儀(Bio-Rad，美國)；熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國)； 電泳儀(Bio-Rad美國)；凝膠成像儀(天能，中國)；培養(yǎng)箱(SANYO，日本)。

SPF級(jí)SD雄性大鼠6只，體質(zhì)量180～220 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(粵)2008-0002)。

1.2 方法

1.2.1 間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、鑒定和分化 分離方法按照先前文章所述[6]。以100 mg/L的水合氯醛麻醉SD大鼠，在體積分?jǐn)?shù)75%的酒精中浸泡3 min，后用碘伏消毒2次。無菌條件下取出雙側(cè)股骨和脛骨，剝離筋膜及組織置于添加青、鏈霉素的DMEM低糖培養(yǎng)基中，10 ml注射器抽取DMEM低糖培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔直至變白，1000 r/min離心8 min棄上清。加入4 ml完全培養(yǎng)基(10%FBS)制成細(xì)胞懸液，置于25 cm2培養(yǎng)瓶中，37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后首次換液，以后每2 d更換1次，待細(xì)胞融合80%～90%時(shí)用2.5 g/L胰酶消化，標(biāo)記為原代。之后按照1∶2的比例傳代。P3代可用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。P3代BMSCs接種于6孔板，密度為5×105/ml，待細(xì)胞融合80%～90%時(shí)消化。將干細(xì)胞重新接種于6孔板，每孔約3×103個(gè)細(xì)胞，加入2 ml/孔干細(xì)胞完全培養(yǎng)液，放入37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后移去舊的培養(yǎng)液，加入2 ml/孔成骨誘導(dǎo)液(10-8mol/L地塞米松，10-2mol/L β-磷酸甘油，50 μg/mL維生素C)，每3 d換液，誘導(dǎo)3周左右，間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成骨分化后鈣結(jié)節(jié)形成，茜素紅染色，鏡下觀察、拍照。評(píng)價(jià)細(xì)胞形態(tài)、排列方式、鈣結(jié)節(jié)等特征，判斷分化是否成功。

1.2.2 含藥培養(yǎng)基的制備 將濃縮提取物溶于二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide,DMSO)DMSO中，過0.22 μm濾膜制成補(bǔ)腎活血湯濃縮液。分裝至無菌管中備用，-20 ℃保存。根據(jù)每個(gè)培養(yǎng)基中培養(yǎng)液的體積，加入一定量體積的濃縮液。

1.2.3 慢病毒轉(zhuǎn)染 以每孔1×104個(gè)/ml的細(xì)胞密度，將BMSCs細(xì)胞接種于12孔板，DMEM+10%FBS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，對(duì)照細(xì)胞轉(zhuǎn)入空載質(zhì)粒，正常細(xì)胞不做任何處理。24 h后細(xì)胞融合度為50%～60%時(shí)，吸去舊的培養(yǎng)液，每孔加入500 μL PBS清洗細(xì)胞，每孔中加入500 μL新鮮無血清的DMEM培養(yǎng)液，穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞加入高滴度慢病毒小心混勻。培養(yǎng)1 h后，加入含有500 μL、100 μL胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液混勻，37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24～48 h之后通過qPCR測(cè)定相對(duì)基因含量，確定轉(zhuǎn)染是否成功，并進(jìn)行細(xì)胞傳代和凍存。

1.2.4 補(bǔ)腎活血湯細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn) P3代BMSCs細(xì)胞復(fù)蘇后消化，按照每孔5000個(gè)細(xì)胞加入96孔板中，每孔100 μL，按照細(xì)胞濃度將細(xì)胞分為4組，加入配制好的補(bǔ)腎活血湯提取物及等量DMSO，補(bǔ)腎活血湯組終濃度分別為25、50、100、200 μg/ml。96孔板中加入含有細(xì)胞的培養(yǎng)液作為空白對(duì)照。37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱中共孵育20 h后取出，加入10 μL的CCK-8試劑，4 h后使用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)其吸光度。通過吸光度判斷補(bǔ)腎活血湯對(duì)細(xì)胞增殖的影響，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)分組與干預(yù) 將穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞、對(duì)照細(xì)胞和空白細(xì)胞分別按照5×105的細(xì)胞密度接種于6孔板中，每類細(xì)胞接種3個(gè)孔，分為正常培養(yǎng)組、補(bǔ)腎活血湯50 μg/ml組和補(bǔ)腎活血湯100 μg/ml組。正常培養(yǎng)組給予體積分?jǐn)?shù)10%的空白培養(yǎng)基，補(bǔ)腎活血湯組分別給予含藥培養(yǎng)基，終濃度為50、100 μg/ml，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 堿性磷酸酶(ALP)活性半定量檢測(cè) 如1.2.5所述，分組培養(yǎng)3 d后棄培養(yǎng)基，PBS漂洗。每孔中加入1% triton的裂解液，離心后取上清加入96孔板中，按照1∶1的比例加入4-硝基苯磷酸二鈉(1 mg/ml)避光，37 ℃下孵育2～4 h。酶標(biāo)儀405 nm處檢測(cè)吸光度。BCA標(biāo)準(zhǔn)曲線按照試劑盒說明進(jìn)行，計(jì)算半定量ALP活性=OD405/樣本蛋白量。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 表1顯示，如1.2.5所述分組，培養(yǎng)3 d后按照RNA提取試劑盒的說明提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。Runx2和Osterix引物由上海生工工程有限公司提供，按照試劑盒說明要求進(jìn)行反應(yīng)。記錄CT值，根據(jù)ΔΔCT法計(jì)算相關(guān)基因的變化。目的基因相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCT，其中ΔCT=CT目的基因-CT內(nèi)參基因，ΔΔCT=ΔCT實(shí)驗(yàn)組-ΔCT對(duì)照組。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.8 BMSCs細(xì)胞中Runx2和Osterix蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 如1.2.5所述，分組培養(yǎng)3 d后裂解細(xì)胞并提取總蛋白。加入5×SDS上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min。濃縮膠每孔加入30 μL樣品。濃縮膠電泳，100 v 20 min；分離膠電泳，200 v至溴酚藍(lán)條帶恰好跑出(約40 min)。取下凝膠，350 mA轉(zhuǎn)膜70 min；將膜取出，封閉液封閉1 h后將膜放入β-actin、Osterix一抗(1∶1000)，Runx2一抗(1∶2000)中，4 ℃反應(yīng)過夜。PBST洗膜5 min×3次；將膜轉(zhuǎn)入HRP標(biāo)記二抗(1∶10000)，室溫孵育1 h，ECL顯影。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的形態(tài)觀察及誘導(dǎo)成骨分化鑒定

圖1顯示，鏡下觀察P3代MSCs細(xì)胞，可以看到細(xì)胞成紡錘狀集落生長，細(xì)胞核明顯，細(xì)胞形態(tài)正常，排列一致。P3代的細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)后染色結(jié)果顯示，有大量成骨細(xì)胞生成，細(xì)胞由梭形變?yōu)闊o定形態(tài)，并有多層重疊現(xiàn)象。茜素紅染色使鈣結(jié)節(jié)呈鮮紅色，說明誘導(dǎo)成功。

圖1 間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定和誘導(dǎo)分化后形態(tài)

2.2 過表達(dá)慢病毒的轉(zhuǎn)染和檢測(cè)

圖2顯示，qPCR檢測(cè)目的基因轉(zhuǎn)錄情況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染Runx2后Runx2表達(dá)明顯上升，說明轉(zhuǎn)染成功。在轉(zhuǎn)染Runx2的細(xì)胞中，Osterix的表達(dá)水平也有增加。與已知的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，Runx2能夠調(diào)控Osterix的表達(dá)。

2.3 補(bǔ)腎活血湯細(xì)胞毒結(jié)果

圖3顯示，根據(jù)抑制率計(jì)算公式，補(bǔ)腎活血湯在25～200 μg/ml對(duì)BMSCs無明顯活性影響(P>0.05)。

圖2 轉(zhuǎn)染后BMSCs中Runx2和Osterix的表達(dá)情況(**P<0.01)

圖3 補(bǔ)腎活血湯對(duì)BMSCs細(xì)胞活性的影響

2.4 補(bǔ)腎活血湯對(duì)BMSCs堿性磷酸酶活性的影響

表2顯示，在穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中與正常培養(yǎng)組比較，補(bǔ)腎活血湯100 μg/ml處理的細(xì)胞磷酸酶活性明顯升高(P<0.05)。補(bǔ)腎活血湯50 μg/ml處理的無明顯差異(P> 0.05)。因此，補(bǔ)腎活血湯能夠提高BMSCs中堿性磷酸酶的活性，促進(jìn)成骨分化。

表2 ALP半定量測(cè)試活性

2.5 補(bǔ)腎活血湯對(duì)BMSCs成骨分化相關(guān)基因表達(dá)情況的影響

表3顯示，與正常培養(yǎng)組細(xì)胞比較，補(bǔ)腎活血湯100 μg/ml處理的空白細(xì)胞、對(duì)照細(xì)胞及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞Runx2基因相對(duì)表達(dá)量明顯增加(P<0.05)。補(bǔ)腎活血湯50 μg/ml處理的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞Runx2基因相對(duì)表達(dá)量明顯增加(P<0.05)。與正常培養(yǎng)組比較，補(bǔ)腎活血湯100 μg/ml處理的空白細(xì)胞、對(duì)照細(xì)胞及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞Ostreix基因相對(duì)表達(dá)量明顯增加(P<0.05)。補(bǔ)腎活血湯50 μg/ml處理的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞Osterix基因相對(duì)表達(dá)量明顯增加(P<0.05)。補(bǔ)腎活血湯確實(shí)能夠調(diào)節(jié)Osterix的表達(dá)，并且通過Runx2的調(diào)節(jié)，與已證實(shí)的研究結(jié)果一致。

2.6 補(bǔ)腎活血湯對(duì)BMSCs成骨分化相關(guān)蛋白表達(dá)情況的影響

圖4顯示，免疫印跡檢測(cè)(western Blot WB)結(jié)果分析顯示，蛋白表達(dá)水平與基因表達(dá)水平一致。在正常培養(yǎng)組中，穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞Runx2和Osterix表達(dá)量明顯增加，證實(shí)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞構(gòu)建成功。與正常培養(yǎng)組比較，補(bǔ)腎活血湯100 μg/ml處理的空白細(xì)胞、對(duì)照細(xì)胞及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞Runx2和Osterix蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯增加(P<0.05)。補(bǔ)腎活血湯50 μg/ml處理的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞Runx2和Osterix蛋白表達(dá)含量明顯增加(P<0.05)。Osterix和Runx2是成骨分化中的重要轉(zhuǎn)錄因子，在過表達(dá)細(xì)胞中補(bǔ)腎活血湯能明顯影響2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，說明補(bǔ)腎活血湯確實(shí)能夠在分子水平上影響成骨細(xì)胞的分化。

表3 Runx、Osterix相對(duì)表達(dá)量比較

圖4 WB檢測(cè)BMSCs轉(zhuǎn)染Runx2過表達(dá)后目的基因表達(dá)情況

3 討論

骨質(zhì)疏松性骨折的治療包括外科治療和骨質(zhì)疏松性治療。外科治療能夠維持骨折復(fù)位后的穩(wěn)定性，抗骨質(zhì)疏松治療主要包括雌激素、降鈣素、阿倫鹽酸類等藥物。臨床上該種治療方法順應(yīng)性差，費(fèi)用高，給中老年患者帶來諸多不便。中醫(yī)藥治療骨質(zhì)疏松性骨折具有明顯優(yōu)勢(shì)，研究表明補(bǔ)腎活血法治療骨質(zhì)疏松性骨折具有良好的臨床療效。文獻(xiàn)報(bào)道，補(bǔ)腎活血湯能夠促進(jìn)骨折愈合，縮短骨愈合時(shí)間[7-8]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎活血湯能夠改善局部血液循環(huán)，提高成骨細(xì)胞活性[9]，可能與補(bǔ)腎活血中藥促進(jìn)BMSCs增殖和成骨分化有關(guān)。而Runx2和Osterix是BMSCs成骨分化過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子。Runx2是決定多能的BMSCs分化為成骨細(xì)胞的關(guān)鍵因子，能促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，維持成骨細(xì)胞的功能并促進(jìn)軟骨細(xì)胞成熟[3]。RT-PCR結(jié)果顯示，在慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs中，Runx2和Osterix都明顯增加，WB的結(jié)果與PCR的結(jié)果一致，相應(yīng)蛋白表達(dá)量增加，說明在細(xì)胞水平上補(bǔ)腎活血湯能夠明顯調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化的能力。在缺失Runx2的純合子小鼠無法存活，骨骼均有軟骨組成，無呼吸而死亡[10]。Osterix基因缺失則能夠完全抑制成骨細(xì)胞分化，BMSCs不能沉淀成骨基質(zhì)。

堿性磷酸酶(alkaline phosphatase ALP)ALP是常用的評(píng)價(jià)成骨分化中早期的檢測(cè)指標(biāo)之一，與成骨鈣化密切相關(guān)。成骨細(xì)胞中的ALP能夠產(chǎn)生磷酸，與鈣生成磷酸鈣沉積于骨中[11]，是一種標(biāo)志性的糖蛋白，在調(diào)節(jié)骨發(fā)育過程中具有雙重性能，參與骨骼和牙齒的發(fā)育礦化，同時(shí)能夠調(diào)節(jié)人體內(nèi)鈣磷等微量元素的平衡。ALP半定量活性測(cè)定顯示，經(jīng)過補(bǔ)腎活血湯作用過的成骨細(xì)胞ALP的含量明顯增加，可能與Osterix的增加有關(guān)。但也有研究指出，Osterix對(duì)ALP表達(dá)活性呈現(xiàn)高抑制、低促進(jìn)的特點(diǎn)[12]。WB的結(jié)果與ALP活性一致，從蛋白表達(dá)水平說明，Runx2能間接通過Osterix提高BMSCs的成骨分化能力。BMSCs表面還存在多種蛋白，多通路調(diào)節(jié)BMSCs的分化、成熟、遷移、歸巢，如Sox9、MydD等，而Runx2/Osterix通路還能夠影響其他細(xì)胞的分化狀態(tài)，使其分化方向改變[13]。因此Runx2/Osterix在成骨細(xì)胞形成中至關(guān)重要，但Osterix基因在調(diào)控成骨細(xì)胞分化過程中是否有其他的轉(zhuǎn)錄因子參與還需進(jìn)一步研究。本文通過慢病毒轉(zhuǎn)染，進(jìn)一步驗(yàn)證Runx2促進(jìn)成骨分化的作用，并為其他通路的研究提供研究基礎(chǔ)。