戴銘卉，孔 薇

(1. 南京中醫(yī)藥大學，南京 210001； 2. 南京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，南京 210001)

慢性腎臟病(CKD)在我國成人中發(fā)病比率高達10.8%[1]。隨著Meijers等提出[2]“腸腎軸”概念，揭示腸道微生物的紊亂在CKD病情進展中扮演重要角色。CKD患者腸道動力下降,潴留的蛋白質被腸道致病菌酵解代謝成多種有毒物質[3-4],誘導CKD患者體內(nèi)氧化應激反應，促進CKD的發(fā)展。

大黃是中醫(yī)治療CKD的代表藥物。胡順金[5]等發(fā)現(xiàn)，大黃泄?jié)犷w粒灌腸能改善患者微炎癥狀態(tài)，減少腎小球硬化和腎間質纖維化的發(fā)生。大黃還可改善患者脂質代謝功能，調(diào)節(jié)鈣磷代謝,減輕腎損傷[6-7]。通腑泄?jié)岱?生大黃20 g，生槐花30 g，六月雪30 g，蒲公英30 g，生牡蠣30 g，附子10 g)是筆者繼承中醫(yī)腎臟病創(chuàng)始人鄒云翔教授學術思想，根據(jù)《黃帝內(nèi)經(jīng)》中“開鬼門，潔凈府，去菀陳莝”的理論為治療原則，以大黃為君藥，前期研究中發(fā)現(xiàn)其在降低慢性腎臟病3～5期患者腸源性尿毒癥毒素、改善臨床癥狀方面具有療效。本實驗旨在基于“腸腎軸”理論，從腸道生物屏障的角度入手，探討通腑泄?jié)岱綄KD大鼠腎功能保護、改善腸道菌群紊亂及炎癥狀態(tài)的情況，以期進一步探明其作用機制。

1 材料

1.1 藥物與試劑

中藥顆粒劑生大黃、生牡蠣、蒲公英、生槐米、六月雪、附子(江陰天江藥業(yè)有限公司)；金水寶膠囊(江西濟民可信有限公司)；硫酸吲哚酚標準品(美國Sigma公司)；腺嘌呤(美國AMRESCO公司)；雙歧桿菌(Bifidobacterium longum,1.2186)購自廣東省食品微生物安全工程技術研究開發(fā)中心；大腸桿菌(Escherichiacoli,1.356)購自南京市中醫(yī)院藥劑室；E.Z.N.A?.Mag-Bind? Stool DNA Kit試劑盒(美國OMEGA公司); TGF-β1兔抗大鼠抗體(美國abcam公司); 兔超敏二步法免疫組化試劑盒、DAB 試劑盒(北京中杉金橋生物有限公司)；大鼠白介素-6ELISA試劑盒(上海西唐生物科技公司)；甲醇(山東瑞星化工有限公司)；乙腈(德國Merck公司)；三氟乙酸(濟南瑞?；び邢薰?。

1.2 主要儀器

Waters515型高效液相色譜儀，配717型自動進樣器、2475型熒光檢測器(美國waters公司)；色譜柱：BDS HyPersil C18色譜柱(大連依利特)；實時定量PCR儀:ABI 7500；METTLER TOLEDO AL-204電子分析天平(梅特勒儀器上海有限公司) 。

2 方法

2.1 分組、模型復制與藥物干預

清潔級雄性SD大鼠32只，6周齡，體質量(180±30)g，由南京中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供(動物許可證號SCXK(浙)2014-0001)。按隨機數(shù)字表法分為空白對照組、模型組、通腑泄?jié)岱浇M、金水寶組4組各8只，于溫度、濕度恒定的動物房中適應性飼養(yǎng)1周。

從實驗第 1 天開始，除空白對照組外其余各組大鼠每日上午灌服腺嘌呤劑量 200 mg/kg/d，至第4周結束。第4周末每組隨機抽取2只大鼠，目內(nèi)眥取血檢測肌酐、尿素水平，提示造模成功[8]。從第5周開始除空白對照組外，其余各組大鼠隔日上午灌服腺嘌呤劑量200 mg/kg/d，至第7周結束。第8周開始各組均停止灌服腺嘌呤，整個實驗過程所有大鼠進水及飲食均不受限制。

實驗開始后第1天根據(jù)組別分別給予相應藥物干預，根據(jù)徐叔云《藥理實驗方法學》[9]標準動物等效劑量法(K=0.018)及6種顆粒劑與生藥材的換算比，給予通腑泄?jié)岱筋w粒劑(生大黃0.6 g·kg-1·d-1，附子0.15 g·kg-1·d-1，生槐花0.54 g·kg-1·d-1，六月雪0.09 g·kg-1·d-1，蒲公英0.36 g·kg-1·d-1，生牡蠣0.045 g·kg-1·d-1)灌胃，每日1次，連續(xù)8周。金水寶組給予中藥灌胃治療，按中國藥典中6 g/d劑量給藥，根據(jù)徐叔云《藥理實驗方法學》標準動物等效劑量法(K=0.018)，則蟲草制劑按照0.54 g/kg/d劑量給予金水寶組大鼠灌胃，每日1次，連續(xù)8周。

模型組大鼠自實驗開始的第1天，給予蒸餾水灌胃，每天1次，連續(xù)8周。

對照組大鼠自實驗開始的第1天，給予蒸餾水灌胃每日2次至第4周末。自第5周開始，隔日上午給予蒸餾水灌胃，每天下午給予蒸餾水灌胃，至第7周末。第8周每天下午給予蒸餾水灌胃。

2.2 標本收集及觀測方法

第8周末采集標本，提前禁食禁水12 h。0.3 ml ·100 g-110%水合氯醛腹腔注射麻醉，隨后給予腹主動脈采血，保存于無肝素采血管中，靜置 20 min，3000 r/min 離心 10 min 后送檢; 采血結束后摘取腎臟矢狀面剖開， 4% 中性甲醛固定24 h，制作病理切片，HE染色備用。

2.3 生化檢測

大鼠尿素、肌酐、尿酸、胱抑素c、白介素-6委托南京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院檢驗科檢測。

2.4 硫酸吲哚酚檢測

采用高效液相色譜-熒光分析法。 標準品儲存液的制備: 甲醇溶解并定容硫酸吲哚酚鉀鹽對照品23.71 mg，配得硫酸吲哚酚濃度為800 μg/mL的貯備液，用乙腈稀釋成最終濃度分別為80、40、20、10、5、0.5、0.1 μg/mL的貯備液備用。色譜條件:流動相: 磷酸二氫鈉緩沖液(0.1%三氟乙酸,pH2.5)-乙腈(92∶8);流速: 1.0 mL/min; 柱溫: 30 ℃; 樣品溫度: 6 ℃; 檢測波長: λex=280 nm，λem=390 nm; 樣品處理方法:3000 r /min,10 min分離血清，-20 ℃保存。小心吸取血清 100 μL 于干凈試管中，加入300 μL 0.2%三氟乙酸-乙腈(10∶90)沉淀蛋白，漩渦混勻30 s后離心 (12000 r /min，8 min，4 ℃)，吸取上層清液 200 μL，微孔濾膜濾過后進行分析。

2.5 轉化生長因子-β1(TGF-β1)檢測

采用免疫組織化學檢驗及半定量分析法。腎臟組織 TGF-β1采用 SP 二步法: 二甲苯脫蠟水洗，微波爐高火修復15 min，3% 過氧化氫孵育10 min，滴加一抗[TGF-β1(1∶50)] 4 ℃ 過夜，DAB 顯色。陰性對照為PBS替代一抗于每次染色。Image-Pro Plus 6.0軟件分析免疫組化方法：每組內(nèi)每張切片連續(xù)挑選6個400倍視野進行拍照，拍照時盡量讓組織充滿整個視野，保證每張照片的背景光一致。應用Image-Pro Plus 6.0軟件選取相同的棕黃色作為判斷所有照片陽性的統(tǒng)一標準，對每張照片進行分析得出每張照片陽性累積光密度值(IOD)。

2.6 腸道菌群檢測

表1顯示，采用Real-timePCR法，所有研究對象均給予直腸按摩法收集糞便于密閉滅菌的試管內(nèi),-80 ℃低溫冰箱內(nèi)保存。稱取75 mg糞便用E.Z.N.A?.Mag-Bind? Stool DNA Kit(OMEGA)提取糞便細菌基因組DNA -20 ℃保存。

換算各標準品1 μL的拷貝數(shù)(長雙歧桿菌1.46× 1011,大腸桿菌2.16× 1011),用于制作標準曲線。反應體系10 μL:2×UltraSYBRMixture5μL, 上下游引物各0.5 μL,DNA模板1 μL,ddH2O 3 μL;反應條件:95 ℃預變性2 min;95 ℃變性15 s,T1℃(雙歧桿菌58 ℃、大腸桿菌60 ℃)退火20 s,68 ℃延伸30 s,T2℃(雙歧桿菌85 ℃、大腸桿菌85.5 ℃)保持15 s讀取定量熒光數(shù)據(jù),共40個循環(huán)。每個樣品均同時做3個平行復孔。

表1 引物序列

2.7 腎臟病理形態(tài)學檢測

腎小管間質纖維化指數(shù)(tubule interstitial fibros is index,TIFI)，TIFI根據(jù)纖維化程度分為4級(0～3級)。具體評分方法如下(20倍目鏡下)：10級：表示無明顯小管間質病變；21級：表示病變程度小于25%；32級：即灶狀損傷，病變程度25%～75%；43級：即多灶狀損傷，代表病變程度大于75%，說明分值由低到高，提示腎小管間質纖維化由輕到重。以上分析均由未知分組的南京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院病理科完成。TIFI=[(1×X1+2×X2+3×X3)/10](X表示病變腎小管間質視野數(shù))。

2.8 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 實驗大鼠一般情況

空白對照組大鼠動作敏捷，無脫毛，體質量增長正常，尿量正常，色淡黃，大便成形偏硬，飲水飲食正常，實驗過程中死亡1只； 模型組大鼠漸出現(xiàn)精神萎靡，反應遲鈍，活動遲緩，皮毛無光澤，毛量偏少，食欲差，飲水量多，尿量多，大便稀，體質量增長緩慢。實驗過程中死亡2只；金水寶組整體狀況與模型組比較有改善，實驗過程死亡2只；通腑泄?jié)岱浇M在毛色、精神狀態(tài)、活動性、體質量方面較模型組明顯改善，實驗過程中死亡2只。

3.2 腸道菌群、炎癥因子及腎小管間質纖維化指標

表2顯示，與空白對照組比較，模型組糞便中大腸桿菌含量明顯升高，雙歧桿菌含量明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，通腑泄?jié)岱浇M糞便中大腸桿菌含量明顯降低，雙歧桿菌含量明顯升高(P<0.05)，IL-6、TGF-β1含量明顯降低 (P<0.05)， TIFI明顯降低 (P<0.05)；與金水寶組比較，通腑泄?jié)岱浇M糞便中大腸桿菌含量明顯降低(P<0.05)， 雙歧桿菌含量明顯升高(P<0.05)，TIFI明顯降低 (P<0.05)，IL-6、TGF-β1 含量無明顯差異。

表2 通腑泄?jié)岱綄β阅I衰竭大鼠雙歧桿菌、大腸桿菌、炎癥因子及腎小管間質纖維化的影響

3.3 尿毒癥毒素指標

表3顯示，與空白對照組比較，模型組血清尿素、肌酐、尿酸、胱抑素C含量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，通腑泄?jié)岱浇M尿素、肌酐、尿酸、胱抑素C、硫酸吲哚酚含量明顯降低(P<0.05)；與金水寶組比較，通腑泄?jié)岱浇M尿酸、胱抑素C含量明顯降低(P<0.05)，硫酸吲哚酚含量無明顯差異。

表3 通腑泄?jié)岱綄β阅I衰竭大鼠尿素、肌酐、尿酸及胱抑素C及硫酸吲哚酚的影響

4 討論

腸道不僅消化食物和吸收營養(yǎng)，腸道屏障還能防止腸腔內(nèi)的有害物質，如細菌和內(nèi)毒素穿過腸黏膜進入體內(nèi)其他組織器官和血液循環(huán)。生物屏障是腸道屏障最主要的組成，腸道生理性菌群則是生物屏障最重要的組成部分。大量研究提示，腸道菌群與慢性腎臟病關系密切。慢性腎臟病患者腸道微生物發(fā)生了顯著變化，腸道中近200種微生物水平明顯失衡，且細菌總數(shù)與腎損害程度正相關，出現(xiàn)大量的機會致病菌，共生益生菌群含量下降，機體免疫功能減弱，腸道屏障功能受損，大量含氮代謝毒素及內(nèi)毒素進入循環(huán)，促進相關炎癥反應的發(fā)生與發(fā)展，最終腎功能損害因此進展。本研究表明，CKD大鼠腸道雙歧桿菌屬菌落較空白對照組大鼠明顯減少，大腸桿菌屬菌落明顯增多，造成這種結果的原因可能與慢性腎臟病大鼠腸道動力下降、腸道內(nèi)益生菌腸道黏附力減弱、定植力異常、蛋白質及氨基酸在腸道潴留、腸道內(nèi)含氮物質增多有關。這種腸道微生物環(huán)境紊亂可能導致“保護性”和“有害性”菌群之間的失調(diào),從而促進炎癥反應[10]。雙歧桿菌占腸道益生菌總量的85%以上，近年研究顯示CKD大鼠給予雙歧桿菌和乳酸桿菌喂飼后，腸道黏膜的通透性改善，提示上述2種益生菌能夠修復CKD大鼠腸道黏膜的損傷。本實驗發(fā)現(xiàn)，通腑泄?jié)岱侥軌蛎黠@增加CKD大鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌含量，降低大腸桿菌含量。結合腎臟生化檢測發(fā)現(xiàn)，通腑泄?jié)岱娇筛纳艭KD大鼠腎損傷相關指標。通腑泄?jié)岱浇M較模型組硫酸吲哚酚含量有明顯差異，提示通腑泄?jié)岱娇山档痛笫笱逯辛蛩徇胚岱雍?。表明通腑泄?jié)岱綄Υ祟惓Ｒ?guī)腎替代療法難以改善的蛋白結合型尿毒癥毒素的清除具有一定優(yōu)勢，體現(xiàn)了標本并治的原則，達到了延緩腎損害進展的目的。同時觀察腎臟組織病理學發(fā)現(xiàn)，通腑泄?jié)岱侥軌蜻M一步減少腎臟纖維化，金水寶雖也有相同作用，但效果不如通腑泄?jié)岱矫黠@。

Ritz等[11]提出“腸腎綜合征”概念，指出腸道微生物失調(diào)、腸道屏障功能障礙和細菌易位是造成血液透析患者系統(tǒng)炎癥狀態(tài)的重要原因。研究表明，微炎癥狀態(tài)存在于近半數(shù)終末期腎臟疾病(ESRD)患者中，這是其心腦血管疾病的主要致病因素，且與營養(yǎng)不良、貧血及高死亡率存在密切關系[12-14]。慢性腎臟病患者腸道動力減弱，腸道屏障損傷，使得被大量增加的大腸桿菌等革蘭氏陰性菌酵解產(chǎn)生的含氮代謝物及內(nèi)毒素入血，細菌移位，加速慢性腎衰患者微炎癥狀態(tài)的發(fā)生發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清IL-6水平較空白對照組明顯升高，證實CKD大鼠存在微炎癥狀態(tài)。通腑泄?jié)岱浇M大鼠血清IL-6與模型組具有顯著差異，可明顯改善CKD大鼠的炎癥狀態(tài)。

轉化生長因子-β1(TGF-β1)在CKD發(fā)生發(fā)展進程中起重要作用, 可通過調(diào)節(jié)基質金屬蛋白酶(MMPs)的表達和活性等多種途徑引起細胞外基質積聚,抑制細胞外基質降解，導致腎間質纖維化，加重腎臟損傷,是目前所知作用最強的促纖維化因子[15]。本實驗顯示，模型組大鼠腎臟組織中TGF-β1過度表達，腎臟間質纖維化嚴重。通腑泄?jié)岱浇M大鼠腎臟組織中TGF-β1表達減少，腎臟纖維化現(xiàn)象較模型組減輕，表明通腑泄?jié)岱骄哂袦p少腎組織中TGF-β1表達的作用。

人工培育蟲草菌絲體研制而成的金水寶膠囊廣泛用于慢性腎衰臨床治療，并有良好的療效。金水寶膠囊能一定程度降低尿毒癥代謝毒素，改善炎癥狀態(tài)，延緩腎損傷發(fā)生。但并不能通過調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂，進而有效抑制CKD的發(fā)生發(fā)展。

本方緊扣“濁毒”病機,結合傳統(tǒng)方義和現(xiàn)代藥理，以大黃為君藥共襄清熱泄?jié)崂麧裰e。大黃是清熱瀉下的要藥，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，大黃能通過改變游離氨基酸在血漿中的含量，達到降低血氨及肝臟荷爾蒙生成的目的；機體氮質的再利用率也可因大黃增強谷氨酰胺合成酶的活性而提高；大黃可下調(diào)殘腎代謝率，保存腎單位，控制肌蛋白的分解，增加肌酐和尿素的排泄。同時，牡蠣有收斂固澀的功效，附子能促進血尿素氮的排泄、改善電解質紊亂，槐花清熱涼血，蒲公英、六月雪清熱解毒利濕，6藥合用，附子燥熱得制，大黃無瀉下過度之虞。采用中藥顆粒劑使用方便，吸收率高。本研究顯示，通腑泄?jié)岱娇赏ㄟ^調(diào)節(jié)CKD模型大鼠腸道菌群，減輕氧化應激，改善炎癥狀態(tài)，減輕腎臟間質纖維化，延緩CKD病程發(fā)展。