周 爽，馬 超，李學(xué)來，原佳樂，劉曉冉，孫堃峰，史國安*

(1. 河南科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，河南 洛陽 471023； 2.洛寧縣農(nóng)業(yè)局，河南 洛寧 471700)

血紅素(Heme)是一類重要的卟啉類化合物，廣泛分布于動物的血液、肌肉以及一些植物組織中。在動物中，血紅素主要存在于血液的紅細胞中，與珠蛋白結(jié)合在一起共同構(gòu)成血紅蛋白；血紅素還作為很多酶的輔基參與許多重要的生理功能。在植物中，血紅素的結(jié)構(gòu)和葉綠素非常相似，都是四吡咯化合物。在生物合成的前期階段，從δ-氨基酮戊酸合成到原卟啉IX合成都是血紅素和葉綠素所共有的。高等植物中的葉綠素生物合成從谷氨酸開始，整個途徑可以分為3步：一是由谷氨酸合成δ-氨基酮戊酸。該過程由谷氨酸t(yī)RNA合成酶(HemA編碼)、谷氨酸t(yī)RNA還原酶(GluTR編碼)以及谷氨酸-1-半縮醛氨基轉(zhuǎn)移酶(GSA編碼)催化完成，是整個葉綠素生物合成途徑的第1個限速步驟。二是由8個δ-氨基酮戊酸合成原卟啉IX。2個δ-氨基酮戊酸在δ-氨基酮戊酸脫水酶(ALAD編碼)的作用下生成1個膽色素原，4個膽色素原在膽色素原脫氨酶(PBD編碼)的作用下生成1個四吡咯，該四吡咯在尿卟啉原III合成酶(UroS編碼)的作用下經(jīng)過一系列反應(yīng)生成尿卟啉原III，尿卟啉原III在尿卟啉原III脫羧酶(HemE編碼)的作用下生成糞卟啉原III，糞卟啉原III在糞卟啉原III氧化酶(CPO編碼)的作用下生成原卟啉原IX，原卟啉原IX在原卟啉原IX氧化酶(PPOX編碼)的作用下生成原卟啉IX。三是由原卟啉 IX合成葉綠素。原卟啉IX是葉綠素和血紅素生物合成途徑中最后一個共同的中間代謝產(chǎn)物。在葉綠素途徑，鎂離子螯合酶(ChlI、ChlD、ChlH編碼)催化鎂離子插入原卟啉IX中形成鎂離子原卟啉IX，隨后鎂離子原卟啉IX甲基轉(zhuǎn)移酶(MTF編碼)、鎂離子原卟啉IX單甲基酯環(huán)化酶(MTC編碼)、脫植基葉綠素a乙烯基還原酶(DVR編碼)、NADPH-原脫植基葉綠素氧化還原酶(POR編碼)、牻牛兒牻牛兒酯還原酶(ChlP編碼)和葉綠素合酶(CS編碼)共同催化合成葉綠素。目前，所有參與高等植物葉綠素生物合成途徑的基因均已發(fā)現(xiàn)。在擬南芥中，葉綠素合成由26個基因編碼的16種酶控制[1-3]。在血紅素途徑，這一過程由亞鐵螯合酶催化，該酶催化亞鐵離子插入原卟啉IX，生成血紅素[1-3]。亞鐵螯合酶由2個同工酶組成，分別由FC1基因及FC2基因編碼，2個基因核苷酸差異極大，但功能相同。血紅素可以作用于葉綠素生物合成過程的限速酶——谷氨酸-tRNA還原酶，從而抑制δ-氨基酮戊酸合成，并進一步抑制葉綠素的合成[4-5]；在擬南芥突變體中的研究表明，由FC1催化合成的血紅素可以充當逆行信號，調(diào)控一系列與光合作用相關(guān)的核基因(Photosynthesis-associatednucleargenes,PhANGs)的表達，如LHCB，RBCS(RuBisCO小亞基)等，從而影響光合作用的發(fā)生[6]。而由FC2催化合成的血紅素則沒有這樣的功能[6]。FC1還可以受到各種外界環(huán)境的誘導(dǎo)而表達[7]。因此可以推測FC1可能是植物體中響應(yīng)外界環(huán)境變化的重要調(diào)控位點，而FC2則主要是組成型表達。血紅素合成及葉綠素合成構(gòu)成了一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，因此，研究植物中的血紅素合成情況對研究葉綠素代謝調(diào)控體系非常重要。

羽衣甘藍白鴿是十字花科蕓薹屬甘藍種中的一個變種，20世紀80年代引入我國，主要作為冬季觀賞植物。目前對白鴿的研究主要集中在其觀賞價值及栽培方法上。羽衣甘藍白鴿是一種典型的葉綠素低溫突變體，其植株在常溫下呈綠色，低溫條件下中心部位的嫩葉不能正常合成葉綠素而變?yōu)榧儼咨?，是一種優(yōu)良的適宜深入研究葉綠素代謝過程的突變體材料。前期的研究顯示，低溫條件下生長的白鴿嫩葉中葉綠素含量遠低于常溫條件下生長的嫩葉[8]。為明確血紅素途徑在葉綠素合成、調(diào)控中的重要作用，研究了低溫對白鴿血紅素含量及血紅素、葉綠素生物合成相關(guān)基因表達情況的影響，探討血紅素合成對葉綠素合成的調(diào)控作用，以期為葉綠素代謝調(diào)控相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

羽衣甘藍白鴿購自重慶天子林業(yè)有限公司。成年植株分別置于溫室(平均溫度20 ℃)及室外(平均溫度5 ℃)培養(yǎng)，分別視為常溫和低溫處理。15 d后取樣。

丙酮、乙醚、鹽酸等化學(xué)試劑均購自重慶東?；び邢薰尽?/p>

引物由華大基因合成，相關(guān)分子生物學(xué)試劑購自TaKaRa公司及Promega公司。

1.2 血紅素提取及測定

準確稱量待測植株的新鮮葉片1 g，置于預(yù)冷的研缽中，加液氮研磨至粉末狀，轉(zhuǎn)入50 mL離心管中。加入10 mL丙酮、蒸餾水混合溶液(V丙酮∶V蒸餾水=99∶1)，用力振蕩均勻，4 000 r/min離心10 min，棄去上清。重復(fù)以上步驟直到離心得到的沉淀物變?yōu)闊o色，再在沉淀物中加入5 mL丙酮、蒸餾水混合溶液(V丙酮∶V蒸餾水=80∶20)，用力振蕩均勻，4 000 r/min離心10 min，棄去上清。重復(fù)這一步驟直到離心得到的沉淀物變?yōu)闊o色為止。此時血紅素在沉淀中。在沉淀中加入5 mL鹽酸、丙酮、蒸餾水混合溶液(V鹽酸∶V丙酮∶V蒸餾水=5∶80∶15)，劇烈振蕩15 min，4 000 r/min離心10 min，取上清，然后向沉淀中再次加入5 mL鹽酸、丙酮、蒸餾水混合溶液(V鹽酸∶V丙酮∶V蒸餾水=5∶80∶15)，劇烈振蕩15 min，4 000 r/min離心10 min，取上清。將兩次得到的上清合并，大約有10 mL。在提取液中加入10 mL乙醚，混合均勻后加入分液漏斗中。將分液漏斗倒置幾下后靜置分層。血紅素位于上層，收集備用。在下層溶液中加入10 mL乙醚，再次提取。將兩次得到的上層溶液合并在一起，倒入分液漏斗，加入等體積的pH值>4的蒸餾水洗滌。靜止分層后取乙醚層，加入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，濃縮至5 mL左右，倒入干凈的50 mL離心管中，用氮氣吹干。在提取好的干燥樣品中依次加入7.44 mL蒸餾水及0.48 mL 5 mol/L NaOH，攪拌至樣品溶解后再加入12 mL蒸餾水和4.08 mL pyridine，再次混合均勻。測量時在樣品中加入幾滴dithionite和50 mmol/L的ferricyanide，測定574.5 nm處的吸光值，依據(jù)參考文獻[9]的方法計算血紅素濃度。每個樣本用3株獨立植株檢測。

1.3 RNA提取及cDNA合成

使用RNAiso Plus(TaKaRa)提取常溫及低溫處理的羽衣甘藍白鴿嫩葉RNA。以總RNA為模板，使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega)合成cDNA第1鏈。相關(guān)操作按照Promega公司說明書進行。

1.4 半定量RT-PCR分析

所檢測的相關(guān)酶及其編碼基因如表1所示。羽衣甘藍和甘藍、擬南芥同為十字花科蕓薹屬，基因序列同源性非常高。根據(jù)GenBank上登陸的甘藍的HemA1、GSA、ALAD、PBD、UroS、HemE1、HemE2、CPO、PPOX、FC1、FC2、ChlI、ChlD、ChlH、MTF、MTC、DVR、ChlP、CS、ACTIN保守序列，以及擬南芥PORB、PORC保守序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計半定量引物，詳見表2。以肌動蛋白基因ACTIN作為內(nèi)參基因，用半定量RT-PCR檢測白鴿嫩葉中血紅素和葉綠素生物合成相關(guān)基因在常溫及低溫條件下的表達情況，重復(fù)3次。利用Quantity one v 4.62分析條帶亮度，利用Origin 7.5處理數(shù)據(jù)，利用Microsoft Excel進行單因素方差分析檢驗。半定量RT-PCR主程序為94 ℃高溫變性5 min；PCR循環(huán)程序為94 ℃高溫變性30 s,54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min；根據(jù)不同基因循環(huán)數(shù)分別設(shè)置26～30個循環(huán)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007進行單因素方差分析及作圖。

表1 半定量RT-PCR檢測的相關(guān)酶及其編碼基因

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對羽衣甘藍白鴿葉色的影響

溫度對羽衣甘藍白鴿葉色影響很大。如圖1所示，常溫條件下，羽衣甘藍白鴿嫩葉表現(xiàn)為正常的綠色；低溫條件下，羽衣甘藍白鴿中心嫩葉變?yōu)榧儼咨?。羽衣甘藍白鴿的成熟葉和老葉在常溫及低溫條件下均為綠色(圖1)。

表2 半定量RT-PCR所用引物

圖1 溫度對羽衣甘藍白鴿葉色的影響

2.2 低溫對羽衣甘藍白鴿嫩葉中血紅素含量的影響

血紅素和葉綠素的前期合成過程完全重合，后期才發(fā)生分支，因此血紅素合成過程對葉綠素合成有重要的調(diào)節(jié)作用。準確測定樣品中的血紅素含量對研究葉色突變體的葉綠素合成過程有重要意義。結(jié)果如圖2所示，白鴿嫩葉中的血紅素含量在低溫條件下為(0.021 2±0.007 01)mg/mL，在常溫條件下僅為(0.000 973±0.000 542 8)mg/mL，且差異極顯著。

*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)；下同

2.3 低溫對白鴿嫩葉中四吡咯化合物共有合成基因表達的影響

在四吡咯化合物的合成過程中，共有9個基因編碼的8種酶是葉綠素及血紅素合成所共有的(表1)。如圖3所示，9個四吡咯化合物共有合成基因的表達水平都在低溫條件下略有下調(diào)，但其表達差異不顯著。HemA1、GSA、ALAD、PBD、UroS、HemE1、HemE2、CPO、PPOX的表達水平在低溫及常溫條件下沒有明顯差異。低溫及常溫條件下相對表達量差異最小的是CPO，常溫條件下為1 928.333 3±427.911 6，低溫條件下為1 854.666 7±452.178 4，下調(diào)了3.82%；相對表達量差異最大的是GSA，常溫條件下為2 050±485.077 3，低溫條件下為1 726.666 7±382.796 7，下調(diào)了15.77%；但差異均未達到顯著水平。

2.4 低溫對白鴿嫩葉中血紅素合成特有基因表達的影響

血紅素生物合成途徑特有的基因FC1和FC2的表達情況如圖4所示。FC1的相對表達量在低溫條件下為2 000±160.934 8，在常溫條件下為1 440±170.587 2。FC1的表達水平在低溫條件下明顯上調(diào)，差異顯著；FC2的相對表達量在低溫條件下為1 650±213.775 6，在常溫條件下為1 743.333 3±212.210 6，差異不顯著。

圖3 不同溫度條件下白鴿嫩葉中的四吡咯化合物共有合成基因表達

圖4 不同溫度條件下白鴿嫩葉中的血紅素合成特有基因的表達

2.5 低溫對白鴿嫩葉中葉綠素合成特有基因表達的影響

葉綠素生物合成途徑特有的基因ChlI、ChlD、ChlH、MTF、MTC、DVR、ChlP、CS的半定量RT-PCR結(jié)果如圖5所示。所有檢測的葉綠素合成特有基因的表達在低溫條件下都下調(diào)，特別是PORB、PORC、ChlP。PORB在低溫下的相對表達量為1 973.333 3±153.079 5，在常溫下的相對表達量為3 163.333 3±70.237 7，差異極顯著；PORC在低溫下的相對表達量為1 916±101.528 3，在常溫下的相對表達量為2 950.666 7±105.457 7，差異極顯著；ChlP在低溫下的相對表達量為1 768.333 3±107.973 8，在常溫下的相對表達量為2 270±175.214 2，差異顯著。其他基因的表達水平在不同溫度條件下差異不顯著。

圖5 不同溫度下白鴿嫩葉中的葉綠素合成特有基因的表達情況

3 結(jié)論與討論

血紅素分子在調(diào)控葉綠素合成過程有重要作用[10-11]。細胞中的血紅素還可作為核質(zhì)信號調(diào)控一系列PhANGs的表達[6, 12]。葉綠素生物合成相關(guān)基因的表達模式差異極大，一部分基因在任何發(fā)育時期、任何外界環(huán)境下表達穩(wěn)定，是組成型表達；而另一部分基因則容易受到發(fā)育階段及外界環(huán)境影響，其表達水平在不同發(fā)育時期、不同外界環(huán)境下差異較大，是外界環(huán)境調(diào)控葉綠素代謝的位點。目前在葉綠素生物合成過程中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了3個具有高度不同表達模式的酶，分別是：谷氨酸-tRNA還原酶(由HemA基因編碼)、鎂螯合酶(由ChlI、ChlD和ChlH基因編碼的三亞基組成)和NADPH-原脫植基葉綠素氧化還原酶(由POR基因編碼)。其中，鎂螯合酶的活性非常容易受到外界環(huán)境的影響，編碼NADPH-原脫植基葉綠素氧化還原酶的POR基因在不同發(fā)育階段及不同光照條件下表達差異很大。因此，這些酶在植物應(yīng)對外界和內(nèi)部條件變化的過程中發(fā)揮著重要的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，白鴿嫩葉中的血紅素含量在低溫條件下遠高于室溫條件下。有研究[8]表明，白鴿嫩葉中的尿卟啉原III含量在低溫與室溫下沒有明顯的差異，糞卟啉原III的含量在低溫條件下甚至略微增加，原卟啉IX和葉綠素含量則在低溫條件下急劇降低。本研究半定量RT-PCR的結(jié)果表明，葉綠素和血紅素合成共有的基因，其表達水平在低溫和常溫條件下差異不顯著，這一結(jié)果與四吡咯合成共同前體尿卟啉原III及糞卟啉原III的含量在低溫和常溫條件下沒有顯著差異相一致[8]。低溫條件下血紅素合成途徑特有的FC1表達水平顯著提高，而葉綠素合成途徑特有的PORB、PORC、ChlP的表達水平則顯著降低，可以推測其共同的底物原卟啉IX流向了血紅素合成途徑，使低溫條件下嫩葉中的血紅素含量急劇增加，高水平的血紅素可以對葉綠素合成進行負調(diào)控，進一步抑制了葉綠素合成及光合作用，導(dǎo)致白鴿嫩葉在低溫條件下葉綠素含量急劇降低，變?yōu)榘咨?/p>

在葉綠素合成過程中，NADPH-原脫植基葉綠素氧化還原酶催化原脫植基葉綠素還原為脫植基葉綠素，這是整個葉綠素合成過程中唯一需要光的步驟[13]。δ-氨基酮戊酸合成是葉綠素合成過程的限速步驟，δ-氨基酮戊酸合成率和光活性的原脫植基葉綠素的水平成反比[14]。在黑暗條件下，葉綠素合成過程只進行到形成原脫植基葉綠素，一旦原脫植基葉綠素的含量達到臨界值，δ-氨基酮戊酸合成就會放緩[15]。NADPH-原脫植基葉綠素氧化還原酶通過與原脫植基葉綠素及NADPH組成三元復(fù)合物的方式來行使其功能[16]。結(jié)合在NADPH-原脫植基葉綠素氧化還原酶活性部位的原脫植基葉綠素是活化的，在光照下會立刻被轉(zhuǎn)變?yōu)槊撝不~綠素[17]。而沒有結(jié)合在NADPH-原脫植基葉綠素氧化還原酶活性部位的原脫植基葉綠素是非活化的，有可能誘導(dǎo)產(chǎn)生單態(tài)氧[18]。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了3種不同的NADPH-原脫植基葉綠素氧化還原酶基因，分別命名為PORA、PORB、PORC。其中，PORA在黃化幼苗剛剛被光照射時高效表達，在幼苗萌發(fā)時也可以檢測到[19]。本研究中白鴿為成年植株，因此沒有檢測PORA的表達情況。PORB在黑暗和光照條件下的表達幾乎是恒定的[19-20]。PORC在光照條件下已經(jīng)轉(zhuǎn)綠的幼苗中表達增強，并主要在綠色植株中表達[21]。PORA、PORB、PORC的功能有部分重合，并在不同的環(huán)境條件下可以互補[22]，說明NADPH-原脫植基葉綠素氧化還原酶是外界環(huán)境調(diào)控葉綠素合成過程的關(guān)鍵點，PORA、PORB、PORC的互補性可以幫助植物適應(yīng)各種外界環(huán)境。PORA和PORB與前片層體的典型結(jié)構(gòu)關(guān)系密切[23]，在葉綠體發(fā)育過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用。最近的研究[24]發(fā)現(xiàn)，NADPH-原脫植基葉綠素氧化還原酶還參與了FLU蛋白對葉綠素合成途徑的負反饋調(diào)控。

低溫條件下，白鴿FC1的表達明顯受到低溫誘導(dǎo)，F(xiàn)C2的表達水平則沒有明顯差異，表明白色嫩葉中急劇增加的血紅素主要由FC1催化合成。白鴿中的PORB和PORC表達水平在低溫下顯著降低，而在其之后的ChlP的表達水平也隨之降低。這些結(jié)果表明FC1、PORB、PORC可能在白鴿低溫白化的過程中起關(guān)鍵作用，彼此之間存在調(diào)控聯(lián)系。