賈少杰，解修超,2*，鄧百萬,2，彭 浩,2

(1.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723001； 2.陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心，陜西 漢中 723001)

靈芝(Ganodermalucidum)又名仙草、木靈芝。隸屬于多孔菌科(Polyporaceae)靈芝屬(GanodermaKarst)真菌。我國《神農(nóng)本草經(jīng)》《本草經(jīng)集注》《本草綱目》等古籍中皆有靈芝記載。據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)校注》記載[1]，靈芝具有養(yǎng)心安神、止咳平喘、延年益壽的功效。現(xiàn)代研究表明，靈芝含有多糖、三萜、麥角甾醇、生物堿等多種活性成分，在降血糖、降血脂、抗腫瘤、提高免疫力和抗氧化[2-5]等方面有極高的藥用價值。

國內(nèi)外對靈芝的分類及親緣關(guān)系的研究從未間斷[6-8]，其中同工酶和DNA分子研究方法應(yīng)用較為廣泛。在真菌親緣關(guān)系研究中常用的同工酶有酯酶、漆酶、超氧化物歧化酶、多酚氧化酶、過氧化氫酶等，其中以酯酶同工酶的酶譜較為穩(wěn)定[9]。酯酶同工酶(Esterase isoenzyme)是指催化作用相同而蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不同的一組酶，是細(xì)胞基因表達(dá)的產(chǎn)物，能夠直接表現(xiàn)出物種在基因水平上的差異，因而在微生物和植物的分類鑒定、親緣關(guān)系研究等方面廣泛應(yīng)用。Liu[10]采用酯酶同工酶技術(shù)對香菇菌株及其雜交后代進(jìn)行了親緣關(guān)系研究，明確了親本與雜種之間的遺傳關(guān)系，為后續(xù)栽培試驗(yàn)提供了理論依據(jù)。將酯酶同工酶和現(xiàn)代DNA分子學(xué)鑒定技術(shù)結(jié)合利用，可有效增加菌種鑒別的可靠性和準(zhǔn)確性[11]。核糖體DNA間隔序列分析(rDNA internal transcribed spacer，rDNA-ITS)是一種常用于真菌的分子水平上的親緣關(guān)系研究方法，可以反映真菌親緣關(guān)系與分類情況[12]，由于真菌ITS區(qū)進(jìn)化速率快，表現(xiàn)出極為廣泛的多態(tài)性，在真菌的鑒定及親緣關(guān)系研究中發(fā)揮著重要作用。因此，rDNA-ITS被廣泛應(yīng)用于真菌的分子學(xué)鑒定[13-15]。Bengtsson-Palme等[16]利用ITS序列對20組真菌和植物進(jìn)行了分類研究。

目前，我國栽培靈芝面臨生產(chǎn)種名混亂的嚴(yán)峻問題[17-18]。陜南是陜西靈芝栽培的主要地區(qū)，由于對陜南靈芝栽培種親緣關(guān)系研究較少，致使該區(qū)靈芝菌種混亂現(xiàn)象尤為突出，嚴(yán)重阻礙了靈芝的工業(yè)化生產(chǎn)，同種異名、同名異種、種名不一情況亟待解決。本研究通過菌絲體生物學(xué)特征、拮抗試驗(yàn)、酯酶同工酶、ITS序列分析對陜南地區(qū)靈芝主要栽培種的生物學(xué)名和親緣關(guān)系進(jìn)行分析研究，旨在為陜南地區(qū)栽培靈芝的育種、生產(chǎn)和保護(hù)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌種及來源 收集漢中、安康、商洛各地區(qū)主栽靈芝菌種10株，菌種名稱及來源詳見表1。

表1 陜南主栽靈芝菌種信息

1.1.2 主要試劑 β-巰基乙醇購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司；三氯甲烷、異丙醇購自天津市富宇精細(xì)化工有限公司；瓊脂糖購自廈門太陽馬生物工程有限公司；乙酸-α-萘酯、乙酸-β-萘酯、固藍(lán)RR鹽、過硫酸銨購自上海拜力生物科技有限公司；甘氨酸、阿魏酸購自天津市天力化學(xué)試劑有限公司；N,N-亞甲雙丙烯酰胺購自天津市福晨化學(xué)試劑廠；溴化乙錠購自美國Biotium公司；三羥甲基氨基甲烷、丙烯酰胺、溴酚藍(lán)購自天津市天力化學(xué)試劑有限公司；Buffer Digestion、Buffer PF、TE Buffer 購自上海生工生物工程有限公司；試驗(yàn)用水均為蒸餾水。

1.1.3 主要儀器 5404R型高速冷凍離心機(jī)購自德國Eppendorf儀器公司；GELDOC型凝膠成像儀購自美國 Bio-Rad儀器公司；DYY-6C型電泳儀購自北京市六一儀器廠；VG3-S25型圓周勻速振蕩器購自德國IKA儀器公司；K960型熱循環(huán)PCR儀購自杭州晶格科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-1F型無菌操作臺購自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；MJ-54A型高壓蒸汽滅菌鍋購自施都凱儀器設(shè)備(上海)有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：土豆200.00 g、葡萄糖20.00 g、瓊脂20.00 g、磷酸二氫鉀3.00 g、硫酸鎂1.50 g、蛋白胨3.00 g、維生素B10.01 g、水1 000 mL，自然pH值；同工酶液體培養(yǎng)基：洋蔥200.00 g、蔗糖10.00 g、阿魏酸0.06 g、水1 000 mL，自然pH值。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化 將10株靈芝菌種分別接種到滅菌的PDA培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫靜置培養(yǎng)6 d。

1.2.2 菌絲形態(tài)及生長速度測定 以5 mm2接種量將活化后菌種接入PDA培養(yǎng)基中，封口膜密封后置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，2 d后使用游標(biāo)卡尺每天固定時間測量菌絲生長速度，觀察其形態(tài)、色澤、邊緣整齊度、密度，每個菌種設(shè)置3個重復(fù)。

1.2.3 液體培養(yǎng)基中菌絲形態(tài)觀察 接種后的液體培養(yǎng)基靜置24 h后，28 ℃、140 r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)7 d，觀察菌絲球大小、形狀、密度、顏色及培養(yǎng)基顏色。

1.2.4 拮抗試驗(yàn) 以5 mm2接種量將活化6 d后的菌種接入PDA培養(yǎng)基中，每個平板接2塊菌種，密封后置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每個菌種3個重復(fù)，記錄拮抗反應(yīng)情況。

1.2.5 酯酶同工酶提取及檢測 稱量1.5 g菌絲體，加3 mL pH值6.8的Tris-HCl混勻，4 ℃、10 000 r/min離心10 min得上清；配制9%的分離膠，蒸餾水封住膠面，50 ℃恒溫凝固30 min，配制6%的濃縮膠(pH值為8.9)日光燈下自然聚合，加8 μL樣品和2 μL甘油溴酚藍(lán)指示劑、5 μL 10%蔗糖溶液混勻后點(diǎn)樣，點(diǎn)樣量6 μL；濃縮膠室溫80 V電泳，待指示劑進(jìn)入分離膠后將電泳儀轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱，指示劑距分離膠底部1 cm處時停止電泳，在乙酸-α-萘酯、乙酸-β-萘酯和固藍(lán)RR鹽染液中37 ℃染色30 min，7%醋酸溶液固定，凝膠成像儀掃描拍照，計算相對遷移率Rf；采用NTSYS-pc 2.11軟件進(jìn)行聚類分析，繪制聚類圖。

1.2.6 DNA的提取及擴(kuò)增 取活化后的菌絲約1.0 g，加液氮研磨成粉末狀；加400 μL Buffer Digestion和4 μL β-巰基乙醇置于65 ℃電熱恒溫水槽1 h，每10 min振蕩混勻一次；加20 μL RNase A(10 mg/mL)，室溫放置3～5 min；加200 μL Buffer PF，混勻，-20 ℃冰箱中放置5 min；4 ℃、10 000 r/min離心5 min取上清，加等體積異丙醇溶液，10 000 r/min離心5 min；75%乙醇溶液漂洗沉淀，打開離心管倒置20 min，50 μL TE Buffer溶解DNA。以ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，72 ℃延伸1 min，57 ℃退火45 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.2.7 基于ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 將PCR擴(kuò)增后的DNA送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行全基因測序，結(jié)果提交GenBank獲得登錄號(MH018022—MH018031)；利用NCBI中的BLAST與GenBank中的已知序列進(jìn)行比對，下載同源性較高的菌種序列，用MEGA 6.0軟件的NJ(Neighbor-joining)方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，利用自展法(Bootstrap，1 000次重復(fù))檢驗(yàn)各分支的置信度。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌種生長速度及菌落形態(tài)

圖1和表2表明，陜南主栽靈芝菌絲生長速度有差異，色澤均為白色，部分在后期會產(chǎn)生黃色斑塊。其中，泰芝2菌種后期會產(chǎn)生淡黃色液滴。平蓋靈芝和大靈芝菌種的菌絲形態(tài)為絨毛狀且菌絲邊緣不整齊，其余菌種菌絲形態(tài)均為絮狀，菌絲邊緣整齊；菌絲密度也因菌種的不同而存在差異，紫靈芝、泰芝2、靈芝1、松杉靈芝、大靈芝、赤芝菌種菌絲體濃密，平蓋靈芝、靈芝2、鹿角靈芝菌種菌絲體較濃密，靈芝菌種菌絲體較稀疏。此外，10株主栽菌種在28 ℃、避光條件下，均能在PDA固體培養(yǎng)基上正常生長，但生長速度各異。靈芝1菌種菌絲生長速度最快，達(dá)到(10.56±0.042)mm/d，松杉靈芝菌種次之，達(dá)到(9.46±0.135)mm/d，泰芝2菌種生長速度最慢，僅為(4.35±0.016)mm/d。10株主栽菌種的平均生長速度為6.93 mm/d，其中靈芝1、松杉靈芝、靈芝2、大靈芝、鹿角靈芝菌種的生長速度均高于平均生長速度，而紫靈芝、平蓋靈芝、泰芝2、靈芝、赤芝菌種生長速度均低于平均生長速度。

圖1 陜南主栽靈芝部分菌種在PDA培養(yǎng)基中的菌絲體形態(tài)(培養(yǎng)6 d)

編號菌種名稱菌絲形態(tài)色澤邊緣整齊度菌絲密度生長速度G1紫靈芝絮狀白色整齊濃密4.64±0.132G2平蓋靈芝絨毛狀白色不整齊較濃密5.02±0.143G3泰芝2絮狀白色、有淡黃色液滴整齊濃密4.35±0.016G4靈芝1絮狀白色、后期有黃斑整齊濃密10.56±0.042G5松杉靈芝絮狀白色整齊濃密9.46±0.135G6靈芝2絮狀潔白整齊較濃密8.67±0.218G7靈芝絮狀白色整齊稀疏5.45±0.164G8大靈芝絨毛狀白色、后期有黃斑不整齊濃密7.78±0.022G9赤芝絮狀白色、后期有黃斑整齊濃密6.22±0.187G10鹿角靈芝絮狀白色整齊較濃密7.12±0.112

2.2 供試菌種的液體形態(tài)特征

表3表明，在28 ℃、140 r/min 避光搖床培養(yǎng)的條件下，10株主栽靈芝菌種中平蓋靈芝、靈芝1、靈芝2、大靈芝、鹿角靈芝菌種的菌絲球?yàn)轭w粒狀，紫靈芝、泰芝2、靈芝菌種的菌絲球?yàn)閳A球狀，松杉靈芝菌種的菌絲球?yàn)樗笮危嘀ゾN的菌絲球?yàn)樾鯛?；紫靈芝、靈芝1、靈芝、赤芝、鹿角靈芝菌種的菌絲球?yàn)榘咨?，平蓋靈芝、松杉靈芝、靈芝2、大靈芝菌種的菌絲球?yàn)榈S色，泰芝2菌種的菌絲球?yàn)榛疑贁?shù)菌絲球呈現(xiàn)黑色；紫靈芝、靈芝1菌種的菌絲球較大，泰芝2、靈芝菌種的菌絲球中等，平蓋靈芝、松杉靈芝、靈芝2、大靈芝、赤芝、鹿角靈芝菌種的菌絲球較??；平蓋靈芝、靈芝1、松杉靈芝、靈芝2、大靈芝、鹿角靈芝菌種的菌絲球密度高，而紫靈芝、泰芝2、靈芝、赤芝菌種的菌絲球密度次之。

表3 陜南主栽靈芝菌種液體形態(tài)特征

2.3 供試菌種拮抗試驗(yàn)結(jié)果

拮抗試驗(yàn)結(jié)果(表4)表明，陜南地區(qū)供試10株靈芝菌種之間拮抗反應(yīng)程度差異較大。菌種紫靈芝、泰芝2之間無明顯拮抗反應(yīng)，表明菌種的體細(xì)胞之間親和，生理特征基本相似，因此初步判斷二者親緣關(guān)系相近；其余菌種之間均發(fā)生拮抗反應(yīng)，但不同菌種之間拮抗反應(yīng)程度不同。菌種赤芝分別與菌種紫靈芝、平蓋靈芝、泰芝2、靈芝1、松杉靈芝、鹿角靈芝之間的拮抗反應(yīng)極強(qiáng)，拮抗線呈現(xiàn)隔離帶型，初步判斷菌種之間細(xì)胞的生理特性差異大，親緣關(guān)系遠(yuǎn)；菌種靈芝2分別與紫靈芝、平蓋靈芝、靈芝1、靈芝、大靈芝、赤芝之間的拮抗反應(yīng)較強(qiáng)，拮抗線較明顯，且菌絲體在拮抗線附近集結(jié)，判定親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；鹿角靈芝分別與紫靈芝、平蓋靈芝、靈芝1之間拮抗反應(yīng)較弱，表明菌種之間親緣關(guān)系較近。

表4 陜南主栽靈芝菌種拮抗試驗(yàn)結(jié)果

注：-、+、++、+++分別表示無拮抗現(xiàn)象、拮抗現(xiàn)象較弱、拮抗現(xiàn)象較強(qiáng)、拮抗現(xiàn)象極強(qiáng)。

2.4 供試菌種酯酶同工酶檢測結(jié)果

2.4.1 酯酶同工酶酶譜 10株靈芝酯酶同工酶酶譜見圖2，模式圖見圖3。結(jié)果表明，10株靈芝菌株共測得酶譜條帶54條，不同菌株的酶譜條帶不同。各菌株的酶譜條帶為3～7條，松杉靈芝菌株的酶譜條帶最多，為7條，鹿角靈芝菌株的酶譜條帶最少，為3條，其余菌株的酶譜條帶為4～6條；54條酶譜條帶的遷移率為0.317～0.634；在遷移率為0.453附近時，一級酶譜條帶18條；菌株松杉靈芝、靈芝2、赤芝酶譜條帶集中且相似，親緣關(guān)系較近；菌株紫靈芝、泰芝2酶譜條帶遷移率相似，親緣關(guān)系相近。

1—10：分別代表菌種G1—G10

圖3 陜南主栽靈芝菌種酯酶同工酶酶譜模式圖

2.4.2 酯酶同工酶聚類分析 圖4表明，10株靈芝菌種在70%的相似水平上分為4類，紫靈芝、泰芝2、鹿角靈芝聚為一類，平蓋靈芝、靈芝1各自單獨(dú)聚為一類，松杉靈芝、靈芝2、靈芝、大靈芝、赤芝聚為一類；在80%的相似水平上，10株靈芝菌種聚為6類，紫靈芝、泰芝2聚為一類，平蓋靈芝、靈芝1、鹿角靈芝各自單獨(dú)聚為一類，松杉靈芝、靈芝、大靈芝聚為一類，靈芝2、赤芝聚為一類。

圖4 陜南主栽靈芝菌種酯酶同工酶聚類分析

2.5 供試菌種ITS序列分析結(jié)果

2.5.1 DNA電泳圖譜分析 紫外凝膠成像(圖5)

1—10：分別代表菌種G1—G10；M: Marker DL 2000

結(jié)果表明，10株靈芝菌種的基因組經(jīng)PCR擴(kuò)增后，條帶整齊明亮，菌株的rDNA-ITS區(qū)域的序列片段長度均在600 bp左右，將測得的基因序列提交NCBI比對。

2.5.2 基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹 10株靈芝菌種的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖6，陜南地區(qū)10株主栽靈芝菌種聚為4類。紫靈芝、平蓋靈芝、泰芝2、鹿角靈芝聚為一個單元，其中，平蓋靈芝與Ganodermasessile(MG773847)聚為一個分支，親緣關(guān)系較近，紫靈芝、泰芝2、鹿角靈芝聚為一個分支；靈芝1與Ganodermasinese(DQ424990)聚為一個單元；松杉靈芝、靈芝與Ganodermatsugae(DQ425004)聚為一個單元；靈芝2、大靈芝、赤芝聚為一個單元，其中，靈芝2與Ganodermasichuanense(KC662402)聚為一個分支，赤芝與Ganodermaresinaceum(KX371964)聚為一個分支。此外，松杉靈芝、靈芝2、靈芝、大靈芝、赤芝聚為一個大分支，表明菌種之間的親緣關(guān)系較近，紫靈芝、平蓋靈芝、泰芝2、靈芝1、鹿角靈芝聚為一個大分支，表明它們之間親緣關(guān)系較近。

圖6 基于ITS序列構(gòu)建的陜南主栽靈芝菌種系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

我國只對少數(shù)種靈芝進(jìn)行了全面研究，區(qū)域栽培種混亂情況極為突出，明確栽培靈芝親緣關(guān)系可有效促進(jìn)其工業(yè)化生產(chǎn)，因此，對栽培靈芝的生物學(xué)名及親緣關(guān)系進(jìn)行研究至關(guān)重要。本研究采用固體PDA培養(yǎng)基研究10株菌種的菌落形態(tài)和生長速度，靈芝1菌種菌絲生長速度最快，達(dá)到(10.56±0.042)mm/d，松杉靈芝菌種次之，達(dá)到(9.46±0.135)mm/d，泰芝2菌種生長速度最慢，僅為(4.35±0.016)mm/d，說明陜南地區(qū)栽培靈芝的生長速度存在明顯差異；采用PDA液體培養(yǎng)基研究菌絲球的顏色、密度、大小等特征，為其液體種的工業(yè)生產(chǎn)提供技術(shù)參考；拮抗試驗(yàn)表明，菌種赤芝與紫靈芝、泰芝2、鹿角靈芝等菌種間的拮抗反應(yīng)極強(qiáng)，表明親緣關(guān)系遠(yuǎn)；基于酯酶同工酶聚類圖與ITS序列分析構(gòu)建的進(jìn)化樹結(jié)果基本一致，松杉靈芝、靈芝2、靈芝、大靈芝、赤芝聚為一個大分支，紫靈芝、平蓋靈芝、泰芝2、靈芝1、鹿角靈芝聚為一個大分支，表明陜南地區(qū)栽培靈芝整體可分為2個大支。

同工酶是真菌細(xì)胞基因表達(dá)的產(chǎn)物，酯酶同工酶的不同可以直接反映菌種之間的差異，其具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，已廣泛應(yīng)用于植物、微生物等領(lǐng)域[19-20]。由于靈芝人工栽培種種間基因交流較多，確保研究的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性還需使用rDNA-ITS技術(shù)進(jìn)行鑒定。Dong等[21]采用rDNA-ITS序列對2株疑似靈芝菌種進(jìn)行了鑒別。Bandh等[22]利用rDNA-ITS分子學(xué)技術(shù)對采自湖水中的多種真菌進(jìn)行了鑒定。二者均采用了單一鑒定技術(shù)對真菌進(jìn)行鑒別，而本研究在對陜南地區(qū)主栽靈芝進(jìn)行生長速度測定、液體菌絲形態(tài)觀察、拮抗反應(yīng)等生物學(xué)特征研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合菌種酯酶同工酶酶譜及rDNA-ITS序列可更加準(zhǔn)確和穩(wěn)定地分析靈芝的親緣關(guān)系，為陜南地區(qū)靈芝的育種、生產(chǎn)和保護(hù)提供理論依據(jù)，同時也為建立栽培靈芝種質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫奠定基礎(chǔ)。