劉曉柱，李銀鳳，趙 燕，張學文*

(1.貴州理工學院 食品藥品制造工程學院，貴州 貴陽 550003； 2.湖南農業(yè)大學 生物科學技術學院，湖南 長沙 410000)

植物花器官發(fā)育是植物生長周期的重要過程，對于大多數農作物而言不僅是決定其產量和經濟價值形成的重要階段，也是植物學界研究的重要領域[1]。對于植物而言，器官形態(tài)的最終形成取決于建立起形態(tài)模式后對細胞分裂方向和分裂頻次的控制和分化，而生長素(Auxin)在這一過程中起決定性作用[2]。

近年來，關于擬南芥雌蕊發(fā)育及模式建成的研究十分活躍，已從遺傳分析和激素調控兩方面獲得了深入的認識[3]。Nemhauser等[4]發(fā)現并提出了雌蕊中頂端至基部生長素濃度梯度模型，在該模型中雌蕊頂端存在高濃度的生長素，促進了柱頭和花柱的伸長和分化，子房中存在中間濃度的生長素，雌蕊底端的花托中存在低水平的生長素。提高頂端生長素濃度可彌補一些花柱促因子的缺失。心皮是構成雌蕊的基本單位，說明心皮發(fā)育過程中存在生長素濃度梯度的分布。Sundberg等[5]利用DR5∶∶GFP系統(tǒng)對擬南芥花器官發(fā)育過程生長素的分布研究指出，在雌蕊發(fā)育過程中，柱頭產生高濃度的生長素，并維持一種頂端至基部的極性分布，子房中存在中間濃度的生長素，胚珠中產生低水平的生長素，保證胚珠的發(fā)育成熟。受精完成后，胚胎中生長素迅速增加。

生長素通過運輸載體進行極性運輸實現其在植物體內的差異分布，而這種差異分布是調控植物生命過程的必要先決條件[6]。PIN家族是目前一種公認的生長素輸出載體，極性分布在細胞膜上，負責生長素的內外運輸，調控生長素濃度梯度動態(tài)平衡[7-8]。擬南芥、水稻、蘋果、麻瘋樹、狗薔薇等的PIN基因已被克隆, 并進行了深入研究，證實了其參與植物器官的生長發(fā)育、向性運動、胚胎發(fā)育等過程[9-11]。

薺菜為十字花科1年生草本植物，在生理特性和遺傳背景上與擬南芥非常接近，但心皮形態(tài)卻差異巨大：薺菜為心形心皮結構，而擬南芥為柱形心皮結構。造成薺菜心皮形態(tài)的獨特性機制還不清楚，推測可能與生長素的極性分布有關，因此構建生長素報告系統(tǒng)DR5∶∶GFP，探析生長素在薺菜心皮發(fā)育中的極性分布，利用RT-PCR克隆薺菜PIN3(CbPIN3)基因編碼區(qū)，并進行生物信息學分析以及表達分析，旨在為揭示薺菜心皮形態(tài)建成奠定分子基礎。

1 材料和方法

1.1 菌株、質粒及植物材料

大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α、根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens) GV3101、質粒pEGAD、pBI121均由湖南農業(yè)大學細胞生物學實驗室保存。

野生型薺菜采自湖南農業(yè)大學耘園教學實習基地。

1.2 試劑及試劑盒

蛋白胨、甘油、瓊脂、常用抗生素購自上海生工生物有限公司；磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鎂、無水乙醇、冰醋酸等均為分析純，購自廣州化學試劑有限公司；TaqDNA聚合酶、T4 DNA 連接酶、各種限制性內切酶、DNA分子質量標準均購自寶生物工程(大連)有限公司；質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

各種抗生素貯存液均按《分子克隆實驗指南》[12]配制。

1.3 培養(yǎng)基

本研究所用LB、YEB、1/2 MS培養(yǎng)基的配制均參考《分子克隆實驗指南》[12]。

1.4 試驗方法

1.4.1 生長素報告系統(tǒng)DR5∶∶GFP的構建 參照Ulmasov等[13]方法，設計了生長素特異響應啟動子DR5，該啟動子序列由3部分組成：生長素響應元件DR5、35S minimal promoter、TMV leader(Ω′)。DR5啟動子全序列設計如下：

AAGCTTCTATACTAAGTTCATGATAATAGTTGCCTTTTGTCTCCCTTTTGTCTCCCTTTTGTCTCCCTTTTGTCTCCCTTTTGTCTCCCTTTTGTCTCCCTTTTGTCTCCCTTTTGTCTCCCTTTTGTCTCCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGATATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAAACAACAAACAACATTACAATTACTATTTACAATTACATCTAGA。

DR5啟動子由上海英駿生物公司合成。

采用HindⅢ、XbaⅠ雙酶切DR5以及載體pBI121，回收酶切產物，T4 DNA連接酶16 ℃過夜反應，然后轉化DH5α感受態(tài)細胞，涂布在含有50 μg/L卡那霉素(Kan)的LB培養(yǎng)基上，挑選白色克隆。堿法小批量抽提法抽提質粒，酶切檢測后送測序，構建正確的載體命名為pBI121-DR5。

采用高保真酶擴增GFP基因，BamHⅠ、SacⅠ雙酶切GFP擴增產物以及載體pBI121-DR5，回收純化酶切產物，T4 DNA連接酶16 ℃過夜反應，然后轉化DH5α感受態(tài)細胞，涂布在含有50 μg/L Kan的LB培養(yǎng)基上，挑選白色克隆。堿法小批量抽提法抽提質粒，酶切檢測后送測序，構建正確的載體命名為pBI121-DR5∶∶GFP。本研究所用引物見表1，由北京華大基因生物有限公司合成。

1.4.2 生長素報告系統(tǒng)DR5∶∶GFP轉化野生型薺菜 利用凍融法將載體pBI121-DR5∶∶GFP轉化至根癌農桿菌GV3101中，通過菌落PCR檢測后，接種至新鮮YEB培養(yǎng)基中(利福平 20 mg/L+慶大霉素30 mg/L+Kan 50 mg/L)，培養(yǎng)24 h。當野生型薺菜植株生長至主花序10 cm左右，次花序在蓮座開始形成時，剪掉已開花或將要開花的花苞，進行薺菜的遺傳轉化，收取成熟轉基因薺菜種子進行篩選檢測。

1.4.3CbPIN3基因的克隆 嚴格按試劑盒說明書步驟提取薺菜葉片RNA，采用甲醛變性膠電泳與核酸紫外分光光度計檢測其質量與濃度，然后反轉錄成cDNA。根據擬南芥PIN3基因(NM_105762.3)核苷酸序列，設計PCR克隆引物(表1)。

表1 研究所用引物

注：下劃線部分為酶切位點。

以薺菜cDNA為模板進行PCR擴增，PCR反應體系為：cDNA模板1 μL， PCR Buffer(10×) 2.5 μL，dNTPs (10 mmol/L) 1 μL，引物CbPIN3-F/R (10 μmol/L)各1 μL，TaqDNA聚合酶1 U，補水至總體積25 μL。PCR反應程序為: 95 ℃預變性3 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)；最后72 ℃終末延伸10 min。將擴增產物切膠回收純化后，連接T載體，轉化DH5α感受態(tài)細胞，涂布在含有IPTG和X-gal的氨芐青霉素LB培養(yǎng)基上，挑選白色克隆。抽提質粒，經酶切檢測后送測序。

1.4.4CbPIN3生物信息學分析 采用NCBI BLAST在線分析CbPIN3基因核苷酸序列同源性；采用DNAStar軟件分析CbPIN3開放閱讀框、氨基酸序列組成、理化性質；采用蛋白質分析系統(tǒng)(http://www.expsy/ch/tools)分析CbPIN3蛋白結構特征；采用ClustalX與MEGA軟件構建CbPIN3蛋白系統(tǒng)進化樹。

1.4.5CbPIN3組織表達分析 提取薺菜根、莖、葉、花、種子部位總RNA，反轉錄成cDNA。qRT-PCR檢測CbPIN3基因表達水平。擴增體系：cDNA 2 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，SYBR Green Mix(2×)10 μL，補水至總體積20 μL。擴增程序：95 ℃預變性 3 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，35個循環(huán)，最后72 ℃終末延伸10 min。以β-actin為內參，按照2-ΔΔCt方法分析CbPIN3相對表達量。

2 結果與分析

2.1 生長素報告系統(tǒng)DR5∶∶GFP的構建

鑒于薺菜與擬南芥心皮形態(tài)差異顯著(圖1)，為分析生長素在薺菜心皮發(fā)育中的作用，構建了生長素報告系統(tǒng)DR5∶∶GFP，該系統(tǒng)包含DR5啟動子與GFP報告基因2個部分。首先人工體外合成DR5，連接到載體pBI121上，替換35S啟動子，然后將GFP基因構建到載體pBI121上，雙酶切檢測GFP基因，最終成功構建了生長素報告系統(tǒng)DR5∶∶GFP(圖2)。

A：薺菜成熟期心皮；B：擬南芥成熟期心皮；bar=1 mm

M：1 kb plus DNA分子質量標準；1—3：pBI121-DR5∶∶GFP酶切結果

2.2 轉生長素報告系統(tǒng)DR5∶∶GFP薺菜植株的獲得

將構建好的生長素報告載體pBI121-DR5∶∶GFP通過凍融法轉化至根癌農桿菌GV3101中，農桿菌通過花序侵染方式轉化野生型薺菜，收取轉基因薺菜種子，播種于盆裝培養(yǎng)土中，待長到2片真葉時噴灑50 mg/L的Kan進行篩選，得到具有抗性的轉基因植株(圖3)，溫室內培養(yǎng)至成熟結種，單株收種子得到T1代種子。T1代種子經消毒，春化后再次種植，經過性狀分離篩選，得到T2代純合薺菜植株。提取Kan抗性薺菜總DNA，PCR法檢測GFP基因，結果4株擴增出GFP目標條帶(圖4)，最終成功獲得轉生長素報告系統(tǒng)DR5∶∶GFP薺菜植株。

圖3 轉基因薺菜Kan抗性篩選

M：1 kb plus DNA分子質量標準；

2.3 轉基因薺菜心皮發(fā)育過程中生長素的檢測

熒光顯微鏡觀察轉基因薺菜花器官的GFP熒光，結果發(fā)現，薺菜花器官發(fā)育過程中生長素分布的特點如下：花瓣中觀察到較低的熒光信號；雄蕊產生較強的熒光信號；柱頭產生高強度的熒光信號；胚珠中有較弱的熒光信號(圖5)。

2.4 薺菜生長素輸出載體PIN3基因的克隆

在擬南芥的向性反應中，PIN3動態(tài)分布參與生長素的極性運輸，包括側向運輸[14]。由于薺菜心皮發(fā)育中生長素的極性分布特點，通過RT-PCR方法獲得了1條2 000 bp的特異性條帶(圖6)。測序結果表明CbPIN3基因編碼區(qū)全長1 950 bp，BLAST比對發(fā)現，所克隆的序列與擬南芥、印度芥菜的PIN3基因及其他的PIN基因具有較高的同源性，表明已成功克隆了薺菜PIN3基因，命名為CbPIN3，并提交GenBank(JF966673)。

A：GFP在薺菜花瓣中表達；B：GFP在薺菜心皮兩側上端表達；C：GFP在薺菜雄蕊中表達；

M：1 kb plus DNA 分子質量標準；

2.5 CbPIN3蛋白結構分析

DNAStar軟件翻譯結果顯示，CbPIN3可編碼649個氨基酸(圖7)，蛋白質分子質量為70.00 ku，等電點為8.14。堿性氨基酸(K、R)個數為48；酸性氨基酸(D、E)個數為46；疏水氨基酸(A、I、L、F、W、V)個數為247；極性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)個數為172；脂肪族氨基酸(I、L、V)個數為145；芳香族氨基酸(F、W、Y)個數為61。

在擬南芥中PIN家族關鍵位點的磷酸化修飾，對其發(fā)揮生長素極性運輸作用至關重要[15]。因此利用NetPhosBac 1.0 Server在線預測CbPIN3蛋白磷酸化情況，結果如圖8所示。CbPIN3蛋白存在13個絲氨酸磷酸化位點，1個蘇氨酸磷酸化位點，說明CbPIN3蛋白功能的發(fā)揮可能也需要磷酸化修飾。

跨膜結構的存在對于生長素運輸載體發(fā)揮功能起著重要作用，因此預測了CbPIN3蛋白跨膜結構情況。結果表明，CbPIN3具有9個跨膜結構域，其中N端5個，C端4個。在C端還有一個整合蛋白，定位于質膜的細胞外表面(ES)(圖9)。在線預測了CbPIN3亞細胞定位，結果顯示，CbPIN3在細胞膜上進行表達。

圖7 CbPIN3基因核苷酸序列及推測氨基酸序列

圖8 CbPIN3蛋白磷酸化位點預測

圖9 CbPIN3蛋白跨膜區(qū)預測分析

2.6 CbPIN3蛋白進化分析

為進一步分析CbPIN3蛋白與其他植物PIN3蛋白的進化關系，利用MEAG 5.1構建PIN3系統(tǒng)進化樹，結果如圖10A所示，CbPIN3與擬南芥PIN3(AtPIN3)親緣關系最近，進化樹上屬同一支；親緣關系最遠的是菠蘿PIN3(AcPIN3)。

進一步分析CbPIN3蛋白與擬南芥PIN3蛋白結構，發(fā)現二者同源性高達90%以上，二者N端和C端都具有幾乎一致的保守跨膜結構域，區(qū)別主要在于中間環(huán)狀結構。根據親水環(huán)數目的差異將擬南芥PIN蛋白分為長PIN蛋白與短PIN蛋白2個亞家族。在長PIN蛋白家族中，CbPIN3與AtPIN3親緣關系最近，在進化樹上同屬于一支；其次與AtPIN7關系較近；與AtPIN6親緣關系最遠(圖10B)。

2.7 CbPIN3組織表達分析

為分析CbPIN3基因表達模式，以qRT-PCR分析薺菜不同組織CbPIN3表達情況。如圖11所示，CbPIN3基因在薺菜根、莖、葉、花、果莢及種子中均有表達，但表達量具有組織差異性。其中，表達量最高的是莖，其次是根、葉及花，果莢中表達量最低，因此，推測CbPIN3可能參與調控薺菜莖、根、葉、花、果實等的發(fā)育過程。

A.CbPIN3蛋白進化樹分析；B.CbPIN3蛋白與擬南芥PIN蛋白進化關系

圖11 CbPIN3組織表達分析

3 結論與討論

作為植物的一種關鍵激素，生長素幾乎參與調控植物生長發(fā)育的各個方面，包括植物對光和重力的向性反應、主根和側根的發(fā)育、頂端優(yōu)勢的維持、器官的建構、維管組織的發(fā)育以及組織培養(yǎng)中的細胞生長等[16-18]。長久以來，由于無法直接顯示生長素在植物體內的分布情況，因此影響了研究的進展。隨著分子生物學技術的進步，生長素誘導基因的發(fā)現是生長素研究史上一大重要突破，生長素早期響應基因的啟動子區(qū)域包含多個生長素反應元件，這些順式作用元件賦予其生長素響應能力。通過對大豆GH3基因生長素反應元件改造，人工構建了生長素反應元件DR5[19-20]，研究表明，DR5比天然的生長素反應元件具有更強的生長素響應能力，可提高5～10倍。DR5可調控報告基因GUS與GFP的表達，因此生長素報告系統(tǒng)DR5∶∶GUS、DR5∶∶GFP可用來在時間和空間上監(jiān)控植物體內生長素的分布。DR5∶∶GUS/GFP已廣泛用于研究擬南芥、煙草、小立碗蘚、棉花、豌豆等多種植物生長發(fā)育過程，取得了非常顯著的效果[21-24]。

通過對轉基因薺菜花器官GFP熒光觀察，發(fā)現在薺菜花瓣中熒光信號較低，表明存在著低水平的生長素；雄蕊中具有較強的熒光信號，表明生長素在花粉囊中大量合成；柱頭上存在高強度熒光信號，推測雄蕊的伸長將生長素富集到花粉粒中，當花粉授到柱頭上時使柱頭維持高濃度的生長素水平；胚珠熒光信號較弱，表明生長素水平較低。這些結果均與擬南芥花器官發(fā)育中生長素分布情況類似，暗示薺菜和擬南芥花器官發(fā)育過程中生長素的分布有著較大的同源性。但二者也有不同：薺菜早期心皮上端兩側熒光信號較中間部分與下部強，而擬南芥的心皮中除柱頭外信號處于均勻分布。由此推測，在薺菜心皮的形態(tài)建成中，存在生長素向兩側上端橫向運輸的機制，導致生長素的極性分布，加快細胞橫向分裂，最終發(fā)育成心形心皮形態(tài)。

生長素發(fā)育調控作用的發(fā)揮需要生長素的極性分布。PIN3作為PIN家族的一員，調控生長素的橫向運輸，參與擬南芥的向光、重力等向性反應。本研究推測在薺菜的心皮發(fā)育中也存在生長素的橫向運輸，是否CbPIN3也參與了這一過程還未知，因此首先克隆了CbPIN3基因，分析了其蛋白結構特征。結果發(fā)現，CbPIN3與擬南芥PIN3高度同源，具有類似的磷酸化位點、跨膜結構域等。為進一步分析PIN3在薺菜生長發(fā)育中的作用，qRT-PCR分析了PIN3基因在薺菜不同組織的表達特征。結果發(fā)現，CbPIN3基因在薺菜多種組織中均表達，但表達量具有組織差異性。其中，莖中表達量最高，果莢中表達量最低，說明CbPIN3可能參與調控薺菜莖、根、葉、花、果實等多種器官的發(fā)育過程。

本研究利用生長素報告系統(tǒng)初步證實生長素參與了薺菜心形心皮的發(fā)育過程，其調控模式與Aloni等[25]、Sundberg等[5]利用DR5∶∶GUS/GFP系統(tǒng)研究擬南芥花器官發(fā)育過程生長素的分布結果較為一致，表明了薺菜與擬南芥心皮發(fā)育中生長素的極性分布差異導致了二者心皮形態(tài)迥異。此外，克隆了CbPIN3基因，發(fā)現PIN3蛋白與擬南芥PIN3蛋白高度同源，暗示其具備生長素橫向運輸能力。