曹 雯， 宛寶山， 陳偉偉， 張冉冉， 樂 軍， 陳 晉

(同濟大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院檢驗科，上海 200433)

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,Mtb)是結(jié)核病(tuberculosis，TB)的病原菌，感染機體后主要寄居在巨噬細(xì)胞內(nèi)。巨噬細(xì)胞作為抵抗Mtb的第一道防線，是先天性免疫和適應(yīng)性免疫聯(lián)系的橋梁[1]。Mtb感染機體后，巨噬細(xì)胞主要通過細(xì)胞膜表面的Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)識別Mtb細(xì)胞表面的膜成分，如脂蛋白、糖脂、甘露糖和海藻糖等，經(jīng)內(nèi)吞作用介導(dǎo)Mtb進(jìn)入巨噬細(xì)胞內(nèi)，加工處理Mtb后提呈給CD4+T細(xì)胞，進(jìn)而觸發(fā)機體的免疫應(yīng)答反應(yīng)[2-3]。脂蛋白(lipoprotein, Lpp)是由Mtb合成并經(jīng)過脂肪修飾后分泌到胞外錨定在細(xì)胞膜上的一種蛋白，其特征是有一個N-端分泌信號肽。脂蛋白在Mtb中表達(dá)十分豐富，生物信息學(xué)預(yù)測Mtb有99個編碼脂蛋白的基因，約占蛋白組中預(yù)測蛋白的2.5%[4-5]。lprG是相對分子質(zhì)量為27000的脂蛋白，與Mtb的毒力相關(guān)，是制備減毒活疫苗的候選因子[6-8]。lprG作為TLR2受體的激動劑，能夠調(diào)節(jié)機體免疫應(yīng)答使得Mtb躲避免疫攻擊[9]。近年來，關(guān)于lprG與巨噬細(xì)胞相互作用的研究得到廣泛關(guān)注，本實驗通過建立穩(wěn)定表達(dá)lprG的THP1細(xì)胞系(人單核源性巨噬細(xì)胞系)，模擬lprG與宿主巨噬細(xì)胞相互作用模型，利用RNA-seq技術(shù)篩選差異表達(dá)基因，采用GO及KEGG通路分析進(jìn)行生物信息學(xué)分析差異基因，為進(jìn)一步研究在Mtb感染宿主過程中，lprG與巨噬細(xì)胞的相互作用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與細(xì)胞

慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pGMLV-CMV-EF1-ZsGreen1-T2A-Puro和包裝質(zhì)粒購自上海吉滿生物科技有限公司；HEK293T和THP1細(xì)胞購自上海生命科學(xué)院。

1.2 主要試劑

PrimeSTAR?HS DNA Polymerase、DH5α購自日本TaKaRa公司；XhoI和EcoRI內(nèi)切酶、T4 DNA Ligase、DNA Ladder購自加拿大Fermentas公司; 質(zhì)粒小抽試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司；LipofectaminTM2000、TRIzol、Superscript VILO cDNA Synthesis Kit購自美國Invitrogen公司；FBS、DMEM、青鏈霉素、胰酶購自美國Thermo Fisher公司；慢病毒濃縮試劑盒購自上海吉滿生物科技有限公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒大抽試劑盒購自德國Qiagen公司；SYBR Green PCR Master Mix購自美國Applied Biosystems公司；Illumina?TruSeq?RNA Sample Preparation Kit v2、TruSeq PE Cluster Kit購自美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank設(shè)計目的基因引物。lprG上游引物序列為5′-CCGGAATTCGCCACCA-TGCATCATCACCATCACCATCG-3′,下游引物序列為5′-CCGCTCGAGCTTATCGTCGTCATCCTTG-TAATCGC-3′，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3.2 慢病毒表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 慢病毒載體pGMLV-CMV-EF1-ZsGreen1-T2A-Puro和目的片段經(jīng)過EcoRI和XhoI雙酶切回收后在16℃下過夜連接，鑒定篩選陽性菌落后送往生工生物工程(上海)股份有限公司合成進(jìn)行測序。

1.3.3 慢病毒的包裝及滴度測定 將空載質(zhì)粒和測序正確的重組質(zhì)粒各取10μg與20μg包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝，培養(yǎng)至48、72h收集病毒上清液，按照濃縮試劑盒說明書進(jìn)行濃縮后保存。

1.3.4 梯度稀釋法測定慢病毒滴度 將細(xì)胞均勻鋪在96孔板中，每個病毒準(zhǔn)備10個離心管，加入90μL完全培養(yǎng)基，第1個管中加入10μL病毒液，混勻后再吸取10μL至第2個管中混勻，依次類推，做10個稀釋度后感染細(xì)胞。培養(yǎng)至第5天在熒光顯微鏡下觀察各孔中熒光細(xì)胞數(shù)量，計算慢病毒滴度，滴度符合實驗條件后進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞感染。

1.3.5 慢病毒感染及篩選THP1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系 第1天后，將THP1懸浮細(xì)胞培養(yǎng)在24孔板中，培養(yǎng)基中含慢病毒和5μg/mL嘌呤霉素，每孔體積為200～300μL，不離心感染。72h后觀察感染效率，待感染成功后繼續(xù)用含5μg/mL嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基篩選至獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系： 穩(wěn)定表達(dá)lprG的THP1細(xì)胞系(lprG-THP1)和空載的THP1細(xì)胞系(NC-THP1)。

1.3.6 qPCR及Western印跡法檢測lprG在THP1細(xì)胞中的表達(dá) 用TRIzol法提取兩組樣品中的總RNA，用Agilent 2100生物分析儀對RNA進(jìn)行質(zhì)檢。按照RNA 2μL、5×VILO Reaction Mix 4μL、10×SuperScript Enzyme Mix 2μL、DEPC水12μL體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄cDNA，qPCR檢測lprG的表達(dá)量。lprG引物序列如下。上游引物為5′-GACGGTCAACG-GCAAGTCC-3′ 、下游引物為5′-GAACACCACGA-AGTCGGCATC-3′；內(nèi)參基因GAPDH引物序列： 上游引物為5′-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3′、下游引物為5′-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3′。根據(jù)qPCR反應(yīng)曲線得到lprG和GAPDH的Ct值，采用ΔΔCt的方法進(jìn)行相對定量，根據(jù)F=2-ΔΔCt計算lprG的表達(dá)差異倍數(shù)。

Western印跡法： 將兩組樣品細(xì)胞放置在冰上，每孔加1 mL PBS清洗2次后，加100 μL RIPA裂解液冰上裂解后將裂解物轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)離心(離心半徑為7.7cm，12000r/min，離心2min)，取上清液。在上清液中加入5×的SDS-PAGE上樣緩沖液20μL,99℃水浴加熱10min，4℃離心10min后進(jìn)行Western印跡法檢測，實驗條件為： 80V和120V電壓下電泳30min和80min，400mA電流下轉(zhuǎn)膜60min，TBST洗滌10min，含5%脫脂牛奶的TBST室溫封閉2h，TBST洗滌3次，10min/次，4℃一抗(1∶1500稀釋)孵育過夜，TBST洗滌3次，10min/次，二抗(1∶4000稀釋)室溫孵育2h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。

1.3.7 轉(zhuǎn)錄組測序與qPCR驗證 對兩組樣品中的總RNA用Illumina?TruSeq?RNA Sample Preparation Kit v2構(gòu)建cDNA文庫。取10ng的cDNA文庫，用TruSeq PE Cluster Kit在cBot系統(tǒng)中進(jìn)行簇生成反應(yīng)，然后在Illumina HiseqTM2500中進(jìn)行雙向測序，每組樣品做3次技術(shù)重復(fù)，取3組數(shù)值的平均值以獲得原始數(shù)據(jù)。使用FASTX-Toolkit軟件(http:∥hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/)對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，去除低值序列得到過濾后的序列數(shù)，然后比對到拼接的基因數(shù)據(jù)庫上，統(tǒng)計每個基因數(shù)據(jù)庫中分別來自兩個樣品的序列數(shù)目，轉(zhuǎn)換為PRKM，利用DEGseq程序包中的MARS模型，計算每個基因在兩個樣品中的表達(dá)豐度差異，F(xiàn)DR<0.001為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。并對差異表達(dá)基因做了GO和KEGG通路顯著性富集分析。選取6個基因C7、IL17C、MSR1、IL36A、WIF1和CTNNA2進(jìn)行qPCR驗證，采用ΔΔCt的方法進(jìn)行相對定量，根據(jù)F=2-ΔΔCt計算表達(dá)差異倍數(shù)，引物序列見表1。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 重組載體構(gòu)建及鑒定

對重組慢病毒載體進(jìn)行PCR產(chǎn)物鑒定，片段為801bp，與目的基因片段大小一致，對比測序結(jié)果與目的基因序列，結(jié)果一致。

2.2 慢病毒滴度

經(jīng)過梯度稀釋法檢測，在熒光顯微鏡下觀察6號孔中約有20個表達(dá)GFP的293T細(xì)胞，含有10×10-8mL慢病毒液，根據(jù)公式計算慢病毒滴度=20TU/(10×10-8)mL=2×108TU/mL，病毒滴度符合實驗要求。

2.3 總RNA檢測結(jié)果

提取NC-THP1和lprG-THP1樣品中總RNA，在Agilent 2100生物分析儀中檢測，濃度分別為71.4ng/μL和92.4ng/μL，RNA完整性數(shù)目(RNA integrity number, RIN)分別為9.8和10，RNA質(zhì)量檢測合格。

2.4 熒光觀察及qPCR和Western印跡法檢測目的基因lprG在THP1細(xì)胞中的表達(dá)

熒光顯微鏡觀察到GFP在THP1細(xì)胞中表達(dá)，表明慢病毒成功侵染THP1細(xì)胞；qPCR檢測到lprG在THP1細(xì)胞中過表達(dá)，Western印跡法檢測到THP1胞質(zhì)中有抗Flag信號，提示有l(wèi)prG的表達(dá)。上述實驗表明成功建立穩(wěn)定表達(dá)lprG的THP1細(xì)胞系，見圖1～3。

圖1 熒光顯微鏡觀察GFP在THP1細(xì)胞中表達(dá)(×100)Fig.1 The expression of GFP in THP1 cells observed with fluorescence microscope(×100)A： 明場 B： 熒光場

圖2 qPCR檢測THP1細(xì)胞中l(wèi)prG的表達(dá)Fig.2 The expression of lprG in THP1 cells identified by qPCRA： 相對表達(dá)量 B： 擴增曲線 C： 熔解曲線

圖3 Western印跡法檢測THP1細(xì)胞中l(wèi)prG的表達(dá)Fig.3 The expression of lprG in THP1 cells identified by Western blotting

2.5 轉(zhuǎn)錄組結(jié)果分析

對兩組樣品測序原始數(shù)據(jù)去除低值序列后，NC-THP1組和lprG-THP1組的過濾后的序列數(shù)分別為44和40，Q30 base分別為96.32%和95.57%。與NC-THP1組相比，lprG-THP1組共有712個基因表達(dá)有顯著性差異，其中419個基因上調(diào)，占58.8%，293個基因下調(diào)，占41.2%。對兩組樣品差異基因進(jìn)行GO分析，分為生物過程、分子功能和細(xì)胞組分3類。在生物過程中，主要為氨基酸及其衍生物代謝，占75.5%，其次為細(xì)胞內(nèi)生物過程，占23.8%。在分子功能中，主要為蛋白質(zhì)結(jié)合，占40.3%，其次為催化活性，占12.04%。在細(xì)胞成分中，主要為細(xì)胞內(nèi)成分，占49.2%。通過對KEGG通路的分析發(fā)現(xiàn)有41個通路在差異表達(dá)基因中富集，其中有56個基因參與免疫應(yīng)答及感染性疾病過程，見圖4。

圖4 免疫應(yīng)答相關(guān)的差異表達(dá)基因Fig.4 The different expression of genes associated with immune response

2.6 qPCR驗證結(jié)果

通過qPCR方法對6個差異表達(dá)基因(IL36A、MSR1、WIF1、IL17C、C7和CTNNA2)進(jìn)行驗證，得到lprG-THP1組與NC-THP1組基因表達(dá)量的比值，結(jié)果顯示IL36A、MSR1、WIF1、IL17C和C7表達(dá)均上調(diào)，CTNNA2表達(dá)下調(diào)，與RNA-seq的結(jié)果相比較，6個基因的差異表達(dá)趨勢一致，證明了RNA-seq的結(jié)果可靠，見圖5。

3 討 論

研究[10-11]表明，lprG能夠通過TLR2途徑抑制巨噬細(xì)胞MHC-Ⅱ抗原處理過程及TNF-α的產(chǎn)生，從而影響CD4+T細(xì)胞對Mtb的識別，導(dǎo)致機體免疫應(yīng)答受損。另有研究[12-13]表明，lprG能阻礙巨噬細(xì)胞內(nèi)吞噬體的成熟及吞噬體和溶酶體的結(jié)合，Mtb因此避開了蛋白酶的降解，得以長期寄存在巨噬細(xì)胞內(nèi)生長繁殖。此外，lprG還參與體內(nèi)三酰甘油的轉(zhuǎn)運過程，通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞內(nèi)三酰甘油的水平影響結(jié)核分枝桿菌的生長速度[14]。由此證明，lprG在免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要作用，其與巨噬細(xì)胞的相互作用影響著結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展。

圖5 通過qPCR方法驗證RNA-seq的結(jié)果Fig.5 Results of real-time qPCR and RNA-seq

近年來，由慢病毒改建而來的慢病毒載體因其高效穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染效率成為常用的研究工具，慢病毒載體可將外源基因有效地整合到宿主染色體上，長期穩(wěn)定地表達(dá)目的基因[15]。本實驗成功構(gòu)建了過表達(dá)lprG的慢病毒載體，與包裝載體共同包裝成慢病毒，通過慢病毒介導(dǎo)的方法建立穩(wěn)定表達(dá)lprG的THP1細(xì)胞系，進(jìn)而利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對穩(wěn)定表達(dá)lprG的THP1細(xì)胞中的差異表達(dá)基因進(jìn)行了篩選，結(jié)果顯示有712個基因表達(dá)受到lprG過表達(dá)的影響。進(jìn)行GO分類分析后發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要分布在細(xì)胞內(nèi)及膜表面，以蛋白質(zhì)結(jié)合、催化活性及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性等功能為主，參與氨基酸及其衍生物代謝和細(xì)胞內(nèi)處理等生物學(xué)過程。KEGG通路分析后顯示差異基因主要富集在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫系統(tǒng)應(yīng)答及感染性疾病途徑中。免疫應(yīng)答的啟動及細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是宿主抵抗Mtb的重要機制，lprG的過表達(dá)影響免疫應(yīng)答通路相關(guān)基因的差異表達(dá)，提示這些基因很可能是Mtb干擾宿主免疫應(yīng)答的作用位點。

轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明lprG-THP1細(xì)胞中C7、IL17C和MSR1的表達(dá)均上調(diào)，該結(jié)果得到了qPCR的驗證。研究[16]表明，C7、IL17C和MSR1在宿主抵抗Mtb的免疫應(yīng)答過程方面發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞可產(chǎn)生補體因子7(complement 7, C7)，高水平的C7會減少細(xì)胞因子TNF-α和IFN-γ的分泌，加重小鼠肺內(nèi)炎癥及肝內(nèi)的Mtb菌量。巨噬細(xì)胞清道夫受體1(macrophage scavenger receptor, MSR1)作為模式識別受體，結(jié)合病原體的配體成分以介導(dǎo)內(nèi)吞作用，它通過調(diào)節(jié)吞噬作用影響免疫應(yīng)答反應(yīng)[17-18]。IL-17C是IL-17家族的一員，IL-17能通過影響P53途徑抑制巨噬細(xì)胞的凋亡以促進(jìn)Mtb的生長[19]。一方面，抑制巨噬細(xì)胞凋亡是Mtb長期寄居在巨噬細(xì)胞內(nèi)的一種策略，另一方面，促進(jìn)細(xì)胞凋亡有利于lprG感染鄰近的巨噬細(xì)胞[20]。在本次實驗過程中，未觀察到lprG-THP1細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象，與文獻(xiàn)中所述lprG不會引起細(xì)胞凋亡一致[10]。目前，在國內(nèi)lprG調(diào)控THP1細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的實驗尚未報導(dǎo)，lprG如何影響C7、IL17C和MSR1基因上調(diào)的具體機制也仍未明確，探討相關(guān)信號通路機制將為發(fā)現(xiàn)治療結(jié)核病的新型靶點提供參考。

Mtb合成前脂蛋白后會在信號肽的指導(dǎo)下完成翻譯后脂肪修飾(如?；?及轉(zhuǎn)運，脂肪修飾方式利于脂蛋白錨定在細(xì)胞壁上，且脂蛋白N-端半胱氨酸殘基的?；沟胠prG具有結(jié)合刺激TLR2的效能。當(dāng)機體感染Mtb后，?；膌prG會被巨噬細(xì)胞TLR識別后隨Mtb吞噬入胞內(nèi)，N-端半胱氨酸未?；膌prG同樣具有激活TLR2的活性[21]。本實驗通過直接擴增Mtb的lprG基因序列，以慢病毒的方式在THP1細(xì)胞中表達(dá)內(nèi)源性的lprG，由于THP1細(xì)胞不具有脂肪修飾lprG相關(guān)酶類，內(nèi)源性與外源性的lprG在修飾方式及轉(zhuǎn)運途徑上也許會有不同，但也不能完全否定內(nèi)源性表達(dá)的lprG不能激發(fā)相似的細(xì)胞效應(yīng)。此外，本實驗所用的THP1細(xì)胞為人單核源性巨噬細(xì)胞，此細(xì)胞模型只能模擬lprG與巨噬細(xì)胞的相互作用，并不能完全反映Mtb與人肺內(nèi)巨噬細(xì)胞相互作用情況。本研究只是初步了解lprG對THP1細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平的影響，lprG與差異基因具體的相互作用機制將在后續(xù)實驗中繼續(xù)開展。