王艷紅，任秋霞，趙慶國（解放軍302醫(yī)院藥學部，北京 100039）

替考拉寧（teicoplanin，TEC）是一種新型糖肽類抗生素，由5個結構相似的化合物TA2-1、TA2-2、TA2-3、TA2-4、TA2-5組成，結構復雜、組分較多含10或11個碳的脂肪鏈，其中TA2-2為主要成分，占各組分相對含量的40%以上[1]。測定替考拉寧谷濃度可為其在臨床的合理應用提供方法學依據，其血藥谷濃度可反映給藥間隔期間藥物暴露量是否高于細菌的MIC與持續(xù)時間，當AUC/MIC≥345 時，可達到最佳治療效果[2]。研究表明[3]，一般感染的患者替考拉寧的谷濃度應＞ 10 mg·L-1，重度感染時應保持在15 mg·L-1以上；血流感染、重癥肺炎及感染性心內膜炎等替考拉寧血藥谷濃度應維持在20 mg·L-1或更高。但由于替考拉寧成分復雜、半衰期較長，患者在常規(guī)劑量使用過程中低于目標治療谷濃度的發(fā)生率較高。同時，替考拉寧在我國臨床實際應用中普遍存在忽視起始負荷劑量或起始負荷劑量及維持劑量偏低的現象。因此，在臨床使用過程中對替考拉寧血藥濃度進行監(jiān)測是非常必要的。

文獻報道的有關替考拉寧血藥濃度測定的方法主要是HPLC分析法，包括HPLC-UV檢測法[4-5]、LCMS/MS檢測法[6]和藥典中刊載的梯度洗脫的反相HPLC檢測法。本研究建立的UPLC紫外檢測法采用了超高壓系統(tǒng)和小粒徑填料色譜柱，具有分離時間短、分離效率高、更加靈敏和節(jié)省試劑等優(yōu)點，經方法學驗證，適用于臨床替考拉寧血藥濃度檢測。

1 儀器與試藥

Agilent 1290型超高壓液相色譜系統(tǒng)，包括G4212A型DAD檢測器、G4220A型二元輸液泵、G4226A型自動進樣器、G1316C型柱溫箱和化學工作站（美國Agilent公司）；QB-600型高速振蕩混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；TGL-16C型高速離心機（上海安亭科學儀器廠）。

替考拉寧標準品（純度：1 mg相當于894 U，中國食品藥品檢定研究院，批號：130374-201002），甲醇、乙腈、三氯甲烷均為色譜純，三氟乙酸為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax SB-C18柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；保護住Zorbax SB-C18柱（2.1 mm×5 mm，1.8 μm）；流動相：乙腈-水（含0.1% TFA）（24.2 : 75.8，v/ v）；流速：0.4 mL·min-1；檢測波長：220 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：5.0 μL。

2.2 溶液的制備

對照品溶液：取替考拉寧標準品約50.02 mg，精密稱定，用30%甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，得5.02 mg·mL-1替考拉寧標準貯備液。精密量取替考拉寧標準貯備液適量，用純化水稀釋成100、400、800 μg·mL-1的標準工作液，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 血漿樣品預處理

取血漿樣品200 μL于1.5 mL的Ep管中，首先加入10 μL 10%高氯酸渦旋震蕩10 s，然后加入乙腈400 μL，渦旋振蕩5 min，11000 r·min-1離心5 min，取上清液400 μL至另一Ep管中，加入萃取劑三氯甲烷400 μL渦旋振蕩5 min，11000 r·min-1離心5 min，取上清液100 μL至另一Ep管中，離心后取上清液5.0 μL進樣分析。

2.4 方法的專屬性

分別取空白血漿、空白血漿+替考拉寧標準品及患者血漿溶液200 μL，按“2.3”項下血漿樣品處理方法和“2.1”項下色譜條件進行測定，結果表明血漿中內源性雜質不干擾血漿中替考拉寧的分析。同時，我們還考察了5例臨床患者血漿（未用替考拉寧）+替考拉寧標準品的檢測情況，結果表明未用替考拉寧的臨床患者血漿內雜質及藥物均不干擾替考拉寧的分析。替考拉寧各組分保留時間分別為3.2 min、4.4 min、5.2 min、8.9 min和9.9 min，理論塔板數按替考拉寧計算大于9500。如圖1所示本法具有較高的專屬性。

圖1 高效液相色譜圖A – 空白血漿，B – 空白血漿+替考拉寧標準品（30 μg·mL-1），C – 患者血漿，D – 臨床患者血漿（未用替考拉寧）+替考拉寧標準品（30 μg·mL-1）；1 – TA2-1，2 – TA2-2，3 – TA2-3，4 – TA2-4，5 – TA2-5Fig 1 The UPLC chromatogramsA – blank plasma; B – blank plasma + teicoplanin standard (30 μg·mL-1); C – patient plasma, D – clinical patient plasma (not used teicoplanin) + teicoplanin standard (30 μg·mL-1); 1 – TA2-1, 2 – TA2-2,3 – TA2-3, 4 – TA2-4, 5 – TA2-5

2.5 標準曲線的建立

分別取不同濃度的替考拉寧標準工作液20 μL，加入健康人空白血漿200 μL，混勻，制成相當于替考拉寧濃度為2.0、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0 μg·mL-1的血漿樣品各3份，按“2.3”項下方法處理，進樣分析。以替考拉寧各組分面積（A）和對替考拉寧血漿濃度（C）作線性回歸，得標準曲線方程：A= 68.85C+ 54.44（R2= 0.9998，n= 3）。結果表明，替考拉寧血藥濃度在2.0 ～ 80.0 μg·mL-1線性關系良好，檢測限為0.65 μg·mL-1。

2.6 回收率實驗

按照標準曲線制備方法配制5.0、30.0、70.0 μg·mL-1低、中、高3個濃度的替考拉寧血漿樣品各5份，按“2.3”項下方法處理后進樣分析，測得替考拉寧峰面積之和與用純化水配制的相應濃度替考拉寧標準品所得的峰面積之和進行比較，計算提取回收率；根據當日標準曲線求得實測濃度，與理論濃度進行比較得出方法回收率，結果見表1。

表1 血漿中替考拉寧的回收率和精密度. n = 5Tab 1 Recovery and precision of teicoplanin in plasma. n = 5

2.7 精密度實驗

取配制的5.0、30.0、70.0 μg·mL-1低、中、高3個濃度的替考拉寧血漿樣品，按“2.3”項下方法處理后進樣分析，每個濃度平行5份，重復測定三批（共計45份），計算批內和批間RSD，結果如表1所示。

2.8 穩(wěn)定性實驗

依據標準曲線制備方法配制5.0、30.0、70.0 μg·mL-1低、中、高3個濃度的替考拉寧血漿樣品，每個濃度平行27份，取3個濃度各3份按“2.3”項下方法立即處理，進樣分析；剩余樣品每個濃度各3份在室溫放置4 h、4 ℃冰箱冷藏24 h、進樣器放置24 h、– 80 ℃冰箱冷凍30 d、60 d、90 d、反復凍融2次、3次后，按“2.3”項下方法處理，UPLC進樣分析，分別以當日的標準曲線計算血漿中藥物濃度。結果表明，血漿中替考拉寧在常溫放置4 h、4 ℃冰箱冷藏24 h、進樣器放置24 h、反復凍融3次、– 80 ℃冰箱冷凍60 d條件下均保持穩(wěn)定，詳見表2。

2.9 臨床應用

14例患者均采用靜脈給藥，采血時間是在給予負荷劑量3 ～ 4次，維持劑量2 ～ 3次后，下一次給藥前抽取靜脈血，為患者谷濃度血樣（肝素抗凝）。樣本3500 r·min-1離心5 min，取血漿200 μL，按“2.3”項下方法處理，根據當日標準曲線定量，測得替考拉寧血藥濃度，詳見表3。

表2 穩(wěn)定性實驗結果. n = 5Tab 2 The results of stability test. n = 5

表3 受試者血藥濃度測定結果Tab 3 Measurement results of plasma drug concentration in patients

3 討論

3.1 流動相體系的選擇

本實驗首先對乙腈-磷酸緩沖鹽體系進行了考察，結果發(fā)現，以磷酸鹽緩沖體系作為流動相，色譜柱柱壓較高，色譜柱易堵塞，樣品分析后需對儀器進行長時間的清洗，工作繁瑣。于是我們對流動相進行優(yōu)化，考察了酸性的乙腈-水（含TFA）體系不同配比對替考拉寧5個主要成分的容量因子和分離度的影響。結果發(fā)現增加乙腈比例可縮短保留時間，適當增加三氟乙酸的含量可提高替考拉寧各組分的峰面積，消除拖尾。當乙腈-水（含0.1% TFA）（24.2 : 75.8）時，替考拉寧各組分容量因子適宜，峰形對稱，保留時間在10 min內。

3.2 內標的選擇

目前，文獻報道的替考拉寧測定方法多為內標法。按照文獻報道的條件，我們分別以哌拉西林鈉和青霉素鈉為內標進行了考察，但最終發(fā)現無論以磷酸鹽作為流動相還是以三氟乙酸為流動相內標均不穩(wěn)定，進樣器放置2 h、4 h，哌拉西林鈉峰面積分別降解為原來的87.8%和79.5%。同時，青霉素和哌拉西林均為臨床常用藥，以此為內標易出現內標受干擾現象。鑒于此，我們選擇用外標法對替考拉寧進行檢測。

3.3 樣品處理方法的選擇

單純采用乙腈沉淀蛋白法對樣品進行處理, 內源性物質干擾較大，峰形不對稱，易對小粒徑填料色譜柱造成阻塞，難以滿足血藥濃度監(jiān)測的要求。結合三氯甲烷提取對樣品進行處理，可將大量雜質萃取到有機相中，使樣品純化，組份濃集，但仍存在部分內源性物質干擾現象。為進一步消除內源性物質干擾，我們利用10%高氯酸加乙腈雙重沉淀蛋白，然后再結合三氯甲烷萃取的方法有效避免了內源性物質干擾現象。

3.4 患者測定結果

本實驗測定的14例患者谷濃度差異顯著，14例患者中有4例（序號3、4、8、9）患者谷濃度低于說明書中建議的有效濃度。替考拉寧耐受性良好，但谷濃度過低易誘發(fā)細菌耐藥，導致感染控制不佳，進而延長患者的治療時間。Wang等[7]研究表明，替考拉寧是時間依賴性抗菌藥物，其抗菌療效和谷濃度密切相關。因此，我們應密切關注患者替考拉寧的血藥濃度，通過監(jiān)測其谷濃度及時調整用藥方案以實現患者的個體化給藥，保證替考拉寧的臨床療效，減少耐藥的發(fā)生率。

綜上，本實驗建立的替考拉寧血藥濃度的測定方法靈敏、準確，操作簡便，回收率較高，可用于臨床替考拉寧血藥濃度的測定，同時對替考拉寧給藥方案的調整，臨床實施個體化治療，確保用藥安全、有效有一定的指導作用。