王歡歡，黃曉舞（解放軍總醫(yī)院制劑中心，北京 100853）

腎樂膠囊是解放軍總醫(yī)院非標準制劑品種，由水蛭、當歸、黨參等五味中藥組成，具有活血化瘀，益氣養(yǎng)血，健脾利濕的功效。用于慢性腎小球腎炎或伴腎功能不全早、中期，證屬氣虛血瘀兼水濕者，癥見神疲乏力，腰酸腰痛，面色無華或晦暗，面浮肢腫，納呆，舌質淡暗或有瘀點瘀斑，苔薄白或膩，脈沉細或細弱。該藥在臨床應用多年，質量可靠，療效顯著。腎樂膠囊現行標準制定時間較早，要求比較低，為了更好的控制其內在質量，有必要對原有標準進行提高。本研究采用HPLC法對腎樂膠囊中阿魏酸含量進行測定，旨在更好的控制腎樂膠囊的質量。

1 儀器與材料

XS105型電子天平（梅特勒精密儀器有限公司）；Agilent 1260液相色譜儀（美國Agilent公司）； KQ-100DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；列孔型電熱恒溫水浴鍋（天津市中環(huán)科技開發(fā)公司）。

腎樂膠囊（解放軍總醫(yī)院自制，批號：SL170501、SL170502、SL170503）；阿魏酸對照品（含量按99.0%計，中國食品藥品檢定研究院，批號：110773-201614）。甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為高純水。

2 方法

2.1 色譜條件[1-3]

色譜柱：Agilent EclipseXDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-1%醋酸水溶液（3 : 7）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：313 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。理論塔板數按阿魏酸峰計應不低于1500。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取阿魏酸對照品13.10 mg（批號：110773-201614，含量按99.0%計），置100 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋到刻度，搖勻；精密量取5 mL，置50 mL的棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含12.97 μg的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取裝量差異項下的內容物，研細，取約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理40 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 取不含黨參、陳皮和當歸藥材的陰性樣品，按“2.2.2”項下供試品溶液的制備方法制成陰性樣品溶液。

2.3 專屬性實驗

取上述對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。結果顯示，供試品中阿魏酸與對照品在相同保留時間處有相同色譜峰，峰形良好，與其他組分峰基線分離度較好，且陰性樣品無干擾。

2.4 線性關系考察

精密量取貯備液適量，分別加甲醇稀釋配成不同濃度對照品溶液。分別精密量取貯備液和不同濃度對照品溶液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得阿魏酸線性回歸方程：y=899395.323x+ 40187.336（r= 0.9999）。結果表明：阿魏酸的濃度在2.5938 μg·mL-1～ 64.8450 μg·mL-1范圍內峰面積呈良好線性關系。

2.5 精密度實驗

取阿魏酸對照品溶液（濃度為12.97 μg·mL-1）適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結果顯示，阿魏酸峰面積RSD為0.62%（n= 6），表明儀器精密度良好。

2.6 重復性實驗

精密稱取批號SL170501供試品6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果表明阿魏酸含量平均值為0.0480 mg·粒-1，RSD為1.58%（n= 6），表明本方法重復性良好。

2.7 中間精密度實驗

取本品（批號：SL170501）細粉適量，在不同時間，由不同的實驗人員，使用不同的儀器（Agilent 1200液相色譜儀），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果表明，含量測定中間精密度實驗阿魏酸平均含量為0.0480 mg·粒-1，RSD為1.15%（n=12），表明該方法測定本品含量中間精密度良好。

圖1 高效液相色譜圖A – 阿魏酸對照品；B – 供試品；C – 陰性樣品；1 – 阿魏酸Fig 1 HPLC chromatograms A – ferulic acid control; B – test sample; C – negative reference substance; 1 – ferulic acid

2.8 回收率實驗

精密稱取本品（批號：SL170501，含量：0.0480 mg·粒-1）細粉約0.5 g，置具塞錐形瓶中，加入濃度為10.4049 μg·mL-1的阿魏酸對照品溶液（阿魏酸對照品批號：110773-201614，含量按99.0%計）5 mL，再精密加入甲醇20 mL，稱定重量，超聲處理40 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得，平行制備6份供試品溶液。按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算回收率。結果見表1。

2.9 穩(wěn)定性實驗

取“2.2.2”項下供試品溶液，室溫放置，分別于0、4.0、7.5、11.0、15.5、20.5、26.0、35.0 h按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，供試品中阿魏酸峰面積RSD為1.24%（n= 8），表明供試品溶液室溫放置35 h內穩(wěn)定。

表1 回收率測定結果. n = 6Tab 1 Results of recovery test. n = 6

2.10 含量測定

取三批中試樣品各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果. n = 3Tab 2 Results of contents determination of samples. n = 3

3 討論

3.1 專屬性考察

在含量測定專屬性實驗中，取缺當歸的陰性樣品，結果陰性樣品溶液的色譜圖中在與對照品溶液色譜圖中相應的位置有相同的色譜峰出現，表明陰性樣品干擾本品阿魏酸的測定。通過查閱相關文獻[1,4]，處方中黨參、陳皮藥材中也含有阿魏酸，為進一步確定干擾來源，分別取當歸、黨參、陳皮和茯苓藥材細粉各約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，照供試品處理方法依法制備供試品溶液，與對照品溶液，按上述色譜條件，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果表明，茯苓中不含阿魏酸，當歸、黨參和陳皮中均含有阿魏酸，故將標準修訂為測定黨參、陳皮和當歸中總阿魏酸含量。

3.2 提取方法和時間考察

在含量測定過程中發(fā)現，供試品采用乙酸乙酯超聲提取時，樣品結塊，分散不均勻，影響本品含量的準確測定，故在原標準的基礎上，對供試品的處理方法進行篩選，優(yōu)化，使本品含量能準確測定。比較了不同提取溶劑[5-8]（水、25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、甲醇、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇和95%乙醇）對樣品含量的影響，結果除采用乙醇提取，供試品溶液色譜圖中主峰前延，影響含量準確測定，其它溶劑供試品色譜圖中，主峰峰形良好，且與相鄰雜質峰分離度符合要求，不干擾本品含量測定，且甲醇提取時，樣品在提取過程中不結塊，分散均勻，能將供試品中阿魏酸提取完全，故確定本品的提取溶劑為甲醇。同時考察了不同提取時間（10、20、30、40、50、60 min）對含量的影響，試驗結果表明，超聲40 min時，本品中阿魏酸能提取完全，故確定本品提取時間為40 min。

3.3 系統(tǒng)耐用性考察

為了考察微小變動因素對本品含量測定的影響，調節(jié)流速（0.9、1.0、1.1 mL·min-1）、柱溫（25、30、35 ℃）和流動相比例（30 : 70、33 : 67、27 : 73）進行試驗，含量分別為：0.0477 mg·粒-1、0.0483 mg·粒-1、0.0475 mg·粒-1、0.0491 mg·粒-1、0.0477 mg·粒-1、0.0482 mg·粒-1、0.0470 mg·粒-1（RSD為1.41%，n= 7），結果表明在測試條件有微小變動時，測定結果基本不受影響，此測試條件的耐用性良好。

3.4 含量限度考察

根據以上含量測定數據，結合大生產工藝因素和不同批次間藥材含量的高低變化，以及成品片重差異范圍等影響含量變化因素，為確保成品質量，暫定本品每粒含黨參、陳皮和當歸以阿魏酸（C10H10O4）計,不得少于0.0450 mg。