趙明香 張琦 趙德國(guó) 向蓉蓉 朱永立 保志娟

摘要：【目的】探討不同價(jià)態(tài)鉻離子對(duì)煙草幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響，為鉻污染下煙草的耐性機(jī)制研究提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳栽茻?7和紅花大金元為試驗(yàn)材料，采用水培試驗(yàn)法研究不同質(zhì)量濃度（0.1、0.5、1.0和5.0 mg/L）Cr3+和Cr6+對(duì)煙草幼苗相關(guān)抗氧化指標(biāo)的影響，分別測(cè)定不同時(shí)間（15和30 d）下鉻脅迫處理和對(duì)照（未添加鉻離子處理）幼苗葉片的超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）活性、丙二醛（MDA）和脯氨酸（pro）含量及根系活力?！窘Y(jié)果】Cr3+處理15 d時(shí)，云煙87的POD和PPO活性及紅花大金元的SOD活性隨著鉻離子濃度的增加而升高;Cr3+脅迫30 d及Cr6+分別脅迫15和30 d時(shí)，兩個(gè)煙草品種幼苗葉片的SOD、POD和PPO活性均隨著鉻離子濃度的增大整體呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，兩個(gè)品種幼苗葉片酶活性最大時(shí)Cr3+濃度為0.5～1.0 mg/L、Cr6+濃度為0.5 mg/L，且鉻脅迫對(duì)云煙87酶活性的抑制作用總體上強(qiáng)于紅花大金元。隨著鉻離子濃度的增加和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，煙草幼苗體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化作用加劇，MDA和pro積累量逐漸增加，高濃度鉻離子脅迫下煙苗根系活力較對(duì)照顯著降低（P<0.05）?！窘Y(jié)論】在水培條件下，Cr6+對(duì)煙苗抗氧化系統(tǒng)的損傷大于Cr3+;與云煙87相比，紅花大金元表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗鉻性。

關(guān)鍵詞： 不同價(jià)態(tài)鉻;煙草;抗氧化關(guān)鍵酶;根系活力

中圖分類(lèi)號(hào)： S572.01? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2018）11-2155-07

Effects of chromium ions with different valences on antioxidant key enzymes and root activity of tobacco seedlings

ZHAO Ming-xiang， ZHANG Qi， ZHAO De-guo， XIANG Rong-rong，

ZHU Yong-li， BAO Zhi-juan*

（College of Tobacco Science， Yunnan Agricultural University， Kunming? ?650201， China）

Abstract：【Objective】In order to provide theoretical basis for the dissection of tolerance mechanism of tobacco under chromium pollution， the influence of chromium ions with different valences on the growth and development of tobacco seedlings was studied. 【Method】Yunyan 87 and Honghuadajinyuan were used as tested tobacco materials. The effects of Cr3+ and Cr6+ with different concentrations（0.1，0.5，1.0 and 5.0 mg/L） on related antioxidant indexes of tobacco seedlings were investigated by using solution culture. The activities of superoxide dismutase（SOD）， peroxidase（POD） and polyphenol oxidase（PPO）， contents of malondialdehyde（MDA） and proline（Pro） in leaves， and root activity of seedlings which were treated with chromium stress and control（without adding chromium ions） were determined at va-rious time points after culturing（15 and 30 d）. 【Result】At 15 d after Cr3 treatment， the POD and PPO activities of Yunyan 87 and SOD activity of Honghuadajinyuan increased with the increase of chromium ions concentration. The activities of SOD， POD and PPO in the seedlings leaves of two tobacco varieties generally increased first and then decreased with the increase of chromium ions concentration when they were treated by Cr3+ stress at 30 d and Cr6+ stress at 15 and 30 d. And under the highest value of enzyme activity of seedlings leaves of the two tobacco varieties， the concentrations of Cr3+ and Cr6+were 0.5-1.0 mg/L and 0.5 mg/L respectively. The inhibitory effect of chromium stress on enzyme activity of Yunyan 87 were? stronger than that on Honghuadajinyuan. With the increase of chromium ions concentration and the extension of stress time， the lipid peroxidation was aggravated in tobacco seedlings， the accumulation of MDA and Pro increased gra-dually， and root activity of tobacco seedlings under high concentration of chromium ion stress significantly decreased compared with that of control（P<0.05）. 【Conclusion】In solution culture， Cr6+ has greater damage to the antioxidant system of tobacco seedlings than Cr3+. Honghuadajinyuan shows stronger resistance to chromium than Yunyan 87.

Key words： chromium with different valences;tobacco;antioxidant key enzyme;root activity

0 引言

【研究意義】鉻作為工業(yè) “五毒”之一，是一種毒性較大的致畸、致突變劑（顧公望和張宏偉，1993），也是地下水、土壤和沉積物中第二常見(jiàn)的金屬污染物（Singh et al.，2013）。目前，土壤鉻污染、農(nóng)產(chǎn)品鉻超標(biāo)及其安全性問(wèn)題已受到國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注。煙草是易富集鉻的植物，重金屬鉻會(huì)影響煙株生長(zhǎng)發(fā)育，最終影響煙葉的產(chǎn)量和質(zhì)量，進(jìn)而降低煙草的利用價(jià)值（趙明香和保志娟，2018）。重金屬的生物毒性不僅與其總量有關(guān)，更大程度上由其形態(tài)分布所決定。不同形態(tài)產(chǎn)生不同的環(huán)境效應(yīng)，直接影響到重金屬的毒性、遷移及其在自然界的循環(huán)。鉻在土壤中主要以Cr6+和Cr3+兩種價(jià)態(tài)存在，不同價(jià)態(tài)鉻的毒性、毒理及生態(tài)效應(yīng)均不同（貢曉飛等，2015）。因此，探討不同價(jià)態(tài)鉻脅迫對(duì)煙草幼苗生理特性的影響，對(duì)研究鉻污染下煙草的耐性機(jī)制具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】通常認(rèn)為，Cr6+對(duì)生物具有較大毒性（Sharma et al.，2003）。有研究表明，Cr6+脅迫能顯著降低植株的生物量、葉綠素含量、葉綠素?zé)晒夂凸夂蠀?shù)，增加丙二醛（MDA）的積累，造成植物細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損傷（石貴玉和陳明媚，2005;曾淑華等，2014;Bukhari et al.，2016）。當(dāng)煙苗受到一定濃度Cr6+脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)可啟動(dòng)超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）等保護(hù)酶系統(tǒng)，通過(guò)提高酶活性來(lái)清除體內(nèi)過(guò)多的活性氧，進(jìn)一步減緩煙株受傷害程度，但Cr6+超過(guò)一定濃度，抗氧化酶活性顯著被抑制，煙苗生理活動(dòng)受限，抑制其生長(zhǎng)發(fā)育（Zamocky and Koller，1999;宋威等，2011）。此外，朱四喜等（2014）、王琪和容麗（2015）研究發(fā)現(xiàn)，高濃度鉻對(duì)植物根系的生物量和根系活力具有抑制作用，會(huì)影響根系發(fā)育。Cr3+是人體必需的營(yíng)養(yǎng)元素，但對(duì)植物是否有類(lèi)似作用尚無(wú)定論（陳永林等，2017）。李建文和黃堅(jiān)（2006）研究發(fā)現(xiàn)，不同價(jià)態(tài)鉻對(duì)水生生物的毒性影響結(jié)果不一致。梁艷茹等（2010）研究表明，Cr3+對(duì)土壤堿性磷酸酶活性的抑制作用明顯強(qiáng)于Cr6+。因此，無(wú)論是Cr6+還是Cr3+，其潛在危險(xiǎn)均十分明顯?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)鉻脅迫下的植物生理開(kāi)展了大量研究（徐勤松等，2002;陳耕云等，2006;Budhari et al.，2016），但鮮見(jiàn)不同價(jià)態(tài)鉻對(duì)水培煙苗生長(zhǎng)發(fā)育影響方面的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】在前期預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用水培試驗(yàn)方法，研究不同價(jià)態(tài)鉻（Cr6+和Cr3+）脅迫對(duì)不同品種煙草幼苗抗氧化關(guān)鍵酶活性和根系活力的影響，旨在探討不同價(jià)態(tài)鉻離子對(duì)煙草生長(zhǎng)發(fā)育的影響，以期為鉻污染下煙草的耐性機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試烤煙品種為云煙87和紅花大金元，種子來(lái)源于玉溪中煙種子有限責(zé)任公司。供試硝酸鉻、重鉻酸鉀、氫氧化鈉、鹽酸等化學(xué)試劑均為分析純，購(gòu)自西隴化工股份有限公司和天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1. 2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2017年7—12月在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院日光溫室中進(jìn)行。采用漂浮育苗方法培育煙苗，待煙苗長(zhǎng)至貓耳期時(shí)，選擇長(zhǎng)勢(shì)較一致的幼苗移植到盛有Hoagland營(yíng)養(yǎng)液（用0.1 mol/L的NaOH和HCl調(diào)節(jié)pH為6.0）的500 mL水培罐中，并用錫箔紙包裹使根部避光以促進(jìn)根系生長(zhǎng)，每天通氣2 h，每3 d更換1次營(yíng)養(yǎng)液（包括測(cè)定指標(biāo)時(shí)間）。預(yù)培養(yǎng)7 d后，向營(yíng)養(yǎng)液中加入Cr3+和Cr6+溶液，使?fàn)I養(yǎng)液中Cr3+和Cr6+最終質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、1.0和5.0 mg/L（Cr3+和Cr6+分別由硝酸鉻和重鉻酸鉀提供），以不添加Cr3+和Cr6+的營(yíng)養(yǎng)液（0 mg/L）為對(duì)照。3次重復(fù)，每罐植煙3株，每處理共植煙9株，分別在處理的第15和30 d時(shí)取樣測(cè)定相關(guān)生理指標(biāo)。

1. 3 測(cè)定指標(biāo)及方法

在煙苗生長(zhǎng)第15和30 d時(shí)，用打孔器取4～6葉位（從根部往上數(shù)）的一定質(zhì)量（2 g）煙葉，立即放入液氮中保存，隨后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。

SOD活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑法，POD活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法，多酚氧化酶（PPO）活性測(cè)定采用鄰苯二酚法，MDA含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法（閔強(qiáng)等，2016），脯氨酸（Pro）含量測(cè)定采用磺基水楊酸法（王學(xué)奎和黃見(jiàn)良，2015），根系活力（第30 d）測(cè)定采用甲烯藍(lán)法（陳綺翎等，2016）。

1. 4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2013和SPSS 19.0進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)分析，采用Origin 2017制圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 不同價(jià)態(tài)鉻離子對(duì)煙草幼苗SOD活性的影響

由圖1可看出，Cr3+和Cr6+分別處理15和30 d時(shí)，云煙87幼苗的SOD活性變化相似，當(dāng)鉻離子濃度為0～0.5 mg/L時(shí)， SOD活性隨鉻離子濃度的增加而增加;當(dāng)鉻離子濃度為0.5～1.0 mg/L時(shí)，SOD活性隨鉻離子濃度的增加明顯下降;當(dāng)鉻離子濃度繼續(xù)增加，SOD活性在平穩(wěn)中略呈下降趨勢(shì)。對(duì)于紅花大金元，Cr3+和Cr6+處理15 d時(shí)，SOD活性隨鉻離子濃度的增加而升高;Cr3+和Cr6+處理30 d時(shí)，SOD活性表現(xiàn)為低促高抑，鉻離子濃度大于0.5 mg/L時(shí)煙苗SOD活性受到抑制。兩個(gè)品種幼苗的SOD活性均隨處理天數(shù)的增加而降低，且高濃度下Cr3+處理的SOD活性高于Cr6+。

2. 2 不同價(jià)態(tài)鉻離子對(duì)煙草幼苗POD活性的影響

由圖2可看出，云煙87幼苗受Cr3+脅迫15和30 d時(shí)，其POD活性隨Cr3+濃度的增加而升高，且均高于對(duì)照，其中0.5～5.0 mg/L處理與對(duì)照差異顯著（P<0.05，下同）;受Cr6+脅迫15和30 d時(shí)，隨鉻離子濃度增加，POD活性呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，均為0.5 mg/L處理POD活性最高，其中不同濃度Cr6+處理的POD活性在脅迫15 d時(shí)均顯著高于對(duì)照，而脅迫30 d時(shí)則較對(duì)照顯著下降。對(duì)于紅花大金元，隨著Cr3+和Cr6+濃度的增加，其幼苗POD活性也呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，POD活性達(dá)最高值的Cr3+和Cr6+濃度分別為1.0和0.5 mg/L;不同濃度Cr3+脅迫15和30 d及Cr6+脅迫15 d的POD活性均顯著高于對(duì)照，而Cr6+脅迫30 d的POD活性則顯著低于對(duì)照。兩個(gè)品種的表現(xiàn)均表明Cr6+的毒性具有時(shí)間累積性，在鉻的價(jià)態(tài)、濃度和脅迫時(shí)間相同時(shí)，紅花大金元幼苗的POD活性高于云煙87。

2. 3 不同價(jià)態(tài)鉻離子對(duì)煙草幼苗PPO活性的影響

由表1可看出，不同濃度Cr3+脅迫15 d時(shí)，云煙87幼苗的PPO活性均顯著高于對(duì)照，但鉻離子濃度增加對(duì)PPO活性的影響不明顯，0.1～5.0 mg/L處理間差異不顯著（P>0.05）;而紅花大金元幼苗的PPO活性則先升高后降低，其中1.0 mg/L處理的PPO活性最高。Cr3+脅迫30 d和Cr6+脅迫15 d時(shí)，兩個(gè)品種幼苗的PPO活性均隨鉻離子濃度的增加呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，PPO活性最高時(shí)的Cr3+和Cr6+濃度分別為1.0和0.5 mg/L。Cr6+處理30 d時(shí)，兩個(gè)品種均為0.1 mg/L處理的葉片PPO活性最高，分別比對(duì)照增加51.93%和47.70%，之后PPO活性隨Cr6+濃度的增加而降低?？傮w來(lái)看，Cr3+對(duì)煙苗的PPO活性有一定促進(jìn)作用;Cr6+在短期內(nèi)可增加煙苗的PPO活性，但隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，高濃度Cr6+則抑制PPO活性;相同條件下，紅花大金元的PPO活性高于云煙87。

2. 4 不同價(jià)態(tài)鉻離子對(duì)煙草幼苗MDA含量的影響

由圖3可看出，在Cr3+和Cr6+脅迫下，隨鉻離子濃度的增加和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，兩個(gè)品種幼苗葉片內(nèi)的MDA含量均逐漸積累，且高濃度鉻離子處理（1.0和5.0 mg/L）均與對(duì)照差異顯著?？傮w來(lái)看，鉻的價(jià)態(tài)和濃度相同時(shí)，脅迫30 d處理煙苗內(nèi)的MDA含量高于脅迫15 d的處理;鉻離子濃度和脅迫天數(shù)相同時(shí)，Cr6+處理煙苗的MDA含量高于Cr3+處理的煙苗;相同條件下，云煙87的MDA含量高于紅花大金元。

2. 5 不同價(jià)態(tài)鉻離子對(duì)煙草幼苗Pro含量的影響

由表2可看出，隨鉻離子濃度的增加和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，兩個(gè)品種幼苗葉片內(nèi)的Pro含量均呈逐漸增加趨勢(shì)?？傮w來(lái)看，鉻離子濃度和脅迫天數(shù)相同時(shí)，Cr6+比Cr3+處理煙苗葉片內(nèi)Pro含量高;Cr3+和Cr6+處理15 d時(shí)，云煙87幼苗葉片內(nèi)的Pro含量高于紅花大金元，而處理30 d時(shí)，紅花大金元幼苗葉片內(nèi)的Pro含量高于云煙87。

2. 6 不同價(jià)態(tài)鉻離子對(duì)煙草幼苗根系活力的影響

從表3可看出，鉻離子濃度對(duì)云煙87根系活力產(chǎn)生低促高抑作用，根系活力最大時(shí)的Cr3+和Cr6+濃度分別為0.5和0.1 mg/L，比對(duì)照提高9.46%和4.19%。在Cr3+和Cr6+脅迫下，紅花大金元的根系活力隨鉻離子濃度增加呈先增加后降低的變化趨勢(shì)，根系活力最大時(shí)的Cr3+和Cr6+濃度均為1.0 mg/L，其中Cr3+處理下根系活力比對(duì)照提高1.33%，Cr6+處理下根系活力低于對(duì)照。在0.1～0.5 mg/L處理下，云煙87根系活力高于紅花大金元;在1.0 mg/L處理下，紅花大金元根系活力高于云煙87。

3 討論

SOD、POD和PPO是植物應(yīng)對(duì)膜脂過(guò)氧化作用的酶促防御系統(tǒng)中的重要保護(hù)酶，與植物抗逆性密切相關(guān)。通常認(rèn)為，低濃度的重金屬脅迫對(duì)煙草生長(zhǎng)有利，而高濃度則會(huì)對(duì)煙草生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用（張艷玲和周漢平，2004;宋威等，2011）。本研究中，低濃度Cr6+脅迫使兩個(gè)品種煙苗的抗氧化酶活性增加，而高濃度Cr6+脅迫使煙苗的抗氧化酶活性降低，清除自由基能力下降，與Davies等（2002）、王愛(ài)云等（2012）的研究結(jié)果相一致。Cr3+雖然是人體和動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)元素，但相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)高濃度的Cr3+會(huì)對(duì)油菜、小麥和玉米產(chǎn)生毒害（Kleiman and Cogliatti，1998;陳永林等，2017）。本研究結(jié)果表明，短期脅迫時(shí)Cr3+能增加云煙87和紅花大金元的抗氧化酶活性，但隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，Cr3+對(duì)兩個(gè)品種煙苗葉片的抗氧化酶活性和根系活力均產(chǎn)生低促高抑的作用，表明高濃度的Cr3+也會(huì)使膜脂發(fā)生氧化，膜透性增加，抗性減弱，對(duì)煙苗造成損傷。此外，本研究發(fā)現(xiàn)Cr6+對(duì)煙苗抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響整體大于Cr3+，原因可能是培養(yǎng)液中的六價(jià)鉻由K2Cr2O7提供，具有較強(qiáng)的氧化性，容易破壞植物的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，對(duì)根細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷，阻礙了植物吸收營(yíng)養(yǎng)成分，并最終影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育（貢曉飛等，2015）。另外，Cr6+毒性雖然大于Cr3+，但與陳永林等（2017）報(bào)道的Cr6+是Cr3+的100倍生物毒性的研究結(jié)果存在較大差異。Cr6+在水體中以CrO42-、Cr2O72-和HCrO4- 3種陰離子形式存在，當(dāng)pH改變時(shí)，六價(jià)鉻陰離子的主要存在形式也不同。植物根系容易吸收CrO42-形式，這種化學(xué)形態(tài)易于穿過(guò)細(xì)胞壁深入到細(xì)胞質(zhì)中，影響蛋白組織和抗氧化酶的形成（Duman and Koca，2014）。在本研究條件下，水培營(yíng)養(yǎng)液pH為6.0，此時(shí)Cr6+主要以HCrO4-形式為主，因而降低了植物根對(duì)Cr6+的吸收，使Cr6+毒性表現(xiàn)減弱。

重金屬脅迫下，植物體內(nèi)的氧化還原平衡容易被打破，積累的過(guò)氧化物使膜脂發(fā)生氧化作用，并使膜脂過(guò)氧化的標(biāo)志物MDA含量增加（陳耕云等，2006;石貴玉等，2007;李覓等，2008;Maksymiec，2011）。本研究結(jié)果也進(jìn)一步驗(yàn)證了該觀點(diǎn)，在Cr3+和Cr6+脅迫下，煙苗的MDA含量隨鉻離子濃度的增加而顯著增加，且處理30 d高于15 d，表明兩個(gè)價(jià)態(tài)的鉻脅迫均會(huì)使煙苗體內(nèi)膜脂過(guò)氧化作用增強(qiáng)，并且在高濃度鉻和脅迫時(shí)間延長(zhǎng)的情況下導(dǎo)致細(xì)胞膜受損加劇。

Pro可保護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng)，維持胞內(nèi)酶的結(jié)構(gòu)，減少胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解，且抗性越強(qiáng)的品種中游離Pro的含量越高（俞慧娜等，2005;王學(xué)奎和黃見(jiàn)良，2015）。本研究中，兩個(gè)品種煙苗體內(nèi)的Pro含量均隨鉻離子濃度的增加而增加。在高濃度鉻長(zhǎng)時(shí)間脅迫下，紅花大金元的游離Pro含量明顯高于云煙87，且紅花大金元的抗氧化指標(biāo)表現(xiàn)相對(duì)較優(yōu)，這可能是該品種擁有一個(gè)或幾個(gè)對(duì)鉻表現(xiàn)出較強(qiáng)抗性的基因所致。因此，今后的研究應(yīng)從基因方面入手，篩選出紅花大金元的抗鉻基因，為抗重金屬煙草品種選育及鉻污染下煙草的耐性機(jī)制研究提供依據(jù)。

4 結(jié)論

不同價(jià)態(tài)鉻脅迫下，隨著鉻離子濃度增加，不同煙草品種幼苗葉片內(nèi)的SOD、POD和PPO活性及煙苗根系活力整體呈先增加后降低的變化趨勢(shì)，在分別處理15和13 d時(shí)，兩個(gè)品種幼苗葉片酶活性最大時(shí)Cr3+濃度為0.5～1.0 mg/L、Cr6+濃度為0.5 mg/L。Cr3+和Cr6+脅迫可對(duì)煙草幼苗葉片膜脂系統(tǒng)造成氧化損傷，隨鉻離子濃度的增加，MDA和Pro積累量逐漸增加?？傮w來(lái)看，煙草幼苗各項(xiàng)抗氧化指標(biāo)對(duì)鉻離子脅迫存在時(shí)間反應(yīng)性和積累性，Cr6+對(duì)煙草幼苗的毒害作用大于Cr3+，紅花大金元較云煙87表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗鉻性。

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