王海波 李璐 蘇新國 張昭其

摘要：【目的】探討EGTA[乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸]結(jié)合熱處理對香蕉果實CBF冷應(yīng)答途徑相關(guān)基因表達(dá)的影響，為研究熱處理提高香蕉果實抗冷性的機(jī)理提供理論參考?！痉椒ā糠謩e采用熱處理（HWD）和EGTA結(jié)合熱處理（EGTA+HWD）兩種方法處理香蕉果實，將處理的香蕉果實置于20 ℃恒溫箱中貯藏3.0 h，然后置于7 ℃恒溫箱中冷藏120.0 h，期間定期采集香蕉果皮，利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測MaDREB1D、MaDREB2C、MaDREB3和MaCOR413基因在20和7 ℃下不同取樣時間點的表達(dá)情況。【結(jié)果】HWD處理的香蕉果實MaDREB1D、MaDREB2C、MaDREB3和MaCOR413基因在20 ℃貯藏0.5 h時表達(dá)量迅速升高，之后又迅速降低，7 ℃冷藏下這4個基因的表達(dá)量整體上呈升高趨勢。與HWD處理相比，EGTA+HWD處理明顯抑制MaDREB1D基因在20 ℃貯藏0.5 h時的表達(dá)，也降低了MaDREB1D基因在7 ℃冷藏過程中的表達(dá)量;EGTA+HWD處理的MaDREB2C、MaDREB3和MaCOR413基因在20 ℃貯藏和7 ℃冷藏中的表達(dá)量一直維持在較低水平?！窘Y(jié)論】EGTA能抑制香蕉果實CBF冷應(yīng)答途徑相關(guān)基因的表達(dá)，推測鈣信號參與香蕉果實CBF冷應(yīng)答途徑。

關(guān)鍵詞： 香蕉;EGTA;熱處理;CBF冷應(yīng)答途徑;基因;表達(dá)分析

中圖分類號： S668.109.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）11-2136-05

Effects of EGTA combined with heat treatment on expression of CBF cold response pathway related genes in banana fruit

WANG Hai-bo1， LI Lu2， SU Xin-guo1， ZHANG Zhao-qi3

（1Guangdong Food and Drug Vocational College，Guangzhou? 510520; 2College of Biotechnology， South China Agricultural University，Guangzhou? 510642; 3College of Horticulture， South China Agricultural

University， Guangzhou? 510642）

Abstract：【Objective】The effects of ethylene glycol-bis-（2-aminoethylether）-N，N，N，N-tetraacetic acid（EGTA） combined with heat treatment on gene expression of CBF cold response pathway related genes in banana fruit were explored to provide theoretical reference for studying the mechanism of heat treatment promoting cold resistance of banana fruit. 【Method】Banana fruits were treated by heat treatment（HWD） and EGTA combined with heat treatment（EGTA+HWD） respectively. The treated banana fruits were stored at 20 ℃ for 3.0 h in incubator，then stored at 7 ℃ for 120.0 h. Banana peels were collected regularly during the storage period. Analysis of the four genes（MaDREB1D， MaDREB2C， MaDREB3 and MaCOR413） expression patterns at 20 and 7 ℃ in banana fruit were conducted using real-time fluorescence quantitative PCR（qRT-PCR）. 【Result】The expression of these four genes in banana fruits was enhanced rapidly after HWD treatment at 0.5 h（20 ℃）， and decreased rapidly later. The expression of these four genes was enhanced by HWD treatment at 7 ℃ in varying degrees. Compared with HWD treatment，EGTA+HWD treatment inhibited the expre-ssion of MaDREB1D at 20 ℃ 0.5 h and reduced the expression of MaDREB1D at 7 ℃ in cold storage. The expression of three genes of MaDREB2C， MaDREB3 and MaCOR413 treated by EGTA+HWD at 20 ℃ and 7 ℃ remained at a low level. 【Conclusion】EGTA inhibits the expression of CBF cold response pathway related genes in banana fruit. It is speculated that calcium signaling may be involved in the regulation of CBF cold response pathway in banana fruit.

Key words： banana; EGTA; heat treatment; CBF cold response pathway; gene; expression analysis

0 引言

【研究意義】香蕉果實屬冷敏性水果，是研究果實冷害的良好材料（陸旺金等，1999;張昭其和龐學(xué)群，2008）。熱處理是提高果蔬抗冷性的有效措施，但熱處理誘導(dǎo)的抗冷機(jī)制尚未清楚，且采后果實中鈣信號與CBF（C-repeat binding transcription factor）冷應(yīng)答途徑是否協(xié)同參與熱處理誘導(dǎo)的抗冷性也不明確。因此，研究EGTA[乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸]結(jié)合熱處理對香蕉果實CBF冷應(yīng)答途徑相關(guān)基因表達(dá)的影響，進(jìn)而探索提高香蕉果實抗冷性的方法，對促進(jìn)香蕉產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】CBF/DREB（C-repeat binding transcription factor/dehydrate responsive element binding factor）冷應(yīng)答途徑是誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗冷性的最重要途徑。熱處理可通過誘導(dǎo)CBF冷應(yīng)答途徑相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)以提高果實的抗冷性，如獼猴桃果實經(jīng)35或45 ℃熱處理10 min后顯著提高果實AcCBF基因的表達(dá)量，可使果實能在0 ℃下冷藏90 d，且有效減輕果實的冷害癥狀（Ma et al.，2014）。鈣信號也可調(diào)控CBF冷應(yīng)答途徑，如含有CaM結(jié)合位點的轉(zhuǎn)錄因子CAMTA/SR能正調(diào)控CBFs基因的表達(dá)，從而提高植物的抗冷性（Peng et al.，2015;Wang et al.，2016）。此外，Doherty等（2009）研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥CAMTA3能與CBF2啟動子區(qū)域CM2序列（CCGCGT）結(jié)合，從而激活CBF2等基因的表達(dá)。目前，有關(guān)Ca2+螯合劑EGTA對植物CBF冷應(yīng)答途徑基因影響的研究報道較少。于涌鯤等（2010）采用0.5～6.0 mmol/L EGTA和A23187（Ca2+載體，增加Ca2+濃度）處理菠菜幼苗時發(fā)現(xiàn)，EGTA濃度越高，CBFs表達(dá)量越少。竇海鷗（2014）采用EGTA處理馬鈴薯幼苗后AtCBF3基因的表達(dá)顯著下調(diào)，利用CaCl2處理則顯著上調(diào)AtCBF3基因的表達(dá)，說明鈣信號可能參與調(diào)控CBF冷應(yīng)答途徑?！颈狙芯壳腥朦c】至今，鮮見有關(guān)EGTA結(jié)合熱處理對香蕉果實CBF冷應(yīng)答途徑相關(guān)基因表達(dá)影響的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】分別采用熱處理（HWD）和EGTA結(jié)合熱處理（EGTA+HWD）兩種方法處理香蕉果實，將處理的香蕉果實置于20 ℃恒溫箱中貯藏3.0 h，然后置于7 ℃恒溫箱中冷藏120.0 h，利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測不同時間點MaDREB1D、MaDREB2C、MaDREB3和MaCOR413基因在香蕉果皮中的表達(dá)模式，探索鈣信號是否參與調(diào)控香蕉果實CBF冷應(yīng)答途徑，為研究熱處理誘導(dǎo)香蕉果實產(chǎn)生抗冷性的機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試香蕉品種為巴西，種植于廣州市番禺香蕉園。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司，THUNDERBIRD SYBR? qPCR Mix試劑盒購自TOYOBO公司。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 樣品處理及采集 采集飽滿度七八成的綠熟香蕉，從中挑選無機(jī)械損傷、無病蟲害、大小均勻的單個香蕉，先后用0.1%漂白粉和0.05%施保功浸泡5 min，晾干備用。熱處理（HWD處理）：將香蕉果實裝在塑料框中加蓋，果實帶框浸入52 ℃熱水處理機(jī)（容積400 L）中3 min，撈出晾干備用。EGTA結(jié)合HWD處理（EGTA+HWD處理）：熱處理后的果實立即放入含有50 mmol/L EGTA的干燥器中浸泡，真空泵抽真空滲透15 min，恢復(fù)常壓5 min，晾干備用。

HWD處理和EGTA+HWD處理后的香蕉果實放入20 ℃恒溫箱中貯藏3.0 h，然后置于7 ℃恒溫箱中冷藏120.0 h，期間定期采集果皮。取樣時間點：20 ℃下0（T1）、0.5（T2）、1.5（T3）和3.0 h（T4）;7 ℃下1.0（T5）、4.0（T6）、8.0（T7）、24.0（T8）、48.0（T9）和120.0 h（T10）。每個時間點設(shè)3個重復(fù)。

1. 2. 2 引物設(shè)計 從香蕉基因組數(shù)據(jù)庫中搜索獲得4個CBF冷應(yīng)答途徑相關(guān)的基因序列（MaDREB1D、MaDREB2C、MaDREB3和MaCOR413），利用Primer 5.0設(shè)計qRT-PCR引物（表1）。

1. 2. 3 總RNA提取及cDNA第一鏈合成 采用熱硼酸法從香蕉果皮中提取總RNA（He，2012），以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其提取質(zhì)量。挑選完整片段的香蕉果皮總RNA為模板，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

1. 2. 4 qRT-PCR檢測 采用THUNDERBIRD SYBR? qPCR Mix對上述處理樣品的MaDREB1D、MaDREB2C、MaDREB3和MaCOR413基因進(jìn)行qRT-PCR檢測。反應(yīng)體系20.00 μL：cDNA模板2.00 μL， SYBR-Green PCR Master Mix 10.00 μL，10 μmol/L 上、下游引物各0.25 μL，ddH2O補(bǔ)足至20.00 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃ 10 s，59 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，進(jìn)行40個循環(huán)。利用熔解曲線分析擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度（Tm，65～95 ℃）。以Actin1為內(nèi)參基因（Chen et al.，2011），MaDREB1D、MaDREB2C、MaDREB3和MaCOR413基因的相對表達(dá)量均利用2-△△Ct法進(jìn)行計算。

1. 3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Sigmaplot 12.5進(jìn)行統(tǒng)計分析及制圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 總RNA提取結(jié)果

從HWD處理和EGTA+HWD處理的香蕉果皮中提取總RNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示?？俁NA中18S和28S條帶清晰可見，無明顯拖尾現(xiàn)象，說明采用熱硼酸法提取的總RNA純度較高、質(zhì)量較好，無明顯降解。用超微量分光光度計測定所有樣品的總RNA紫外吸收值（A260/A280）為1.80～2.00，進(jìn)一步說明RNA質(zhì)量較好，可用于后續(xù)定量表達(dá)分析。

2. 2 HWD處理和EGTA+HWD處理對香蕉果實MaDREB1D基因表達(dá)的影響

從圖2可知，HWD處理的MaDREB1D基因表達(dá)量在20 ℃ 0.5 h（T2）時迅速升高，之后迅速下降至其表達(dá)量的50%左右，當(dāng)香蕉果實轉(zhuǎn)入7 ℃下冷藏時，MaDREB1D基因的表達(dá)量呈升—降—升的變化趨勢。與HWD相比，EGTA+HWD處理明顯抑制MaDREB1D基因在20 ℃ 0.5 h（T2）時的表達(dá)，也降低了MaDREB1D基因在7 ℃冷藏過程中的表達(dá)量。除7 ℃ 8.0 h（T7）外，EGTA+HWD處理的MaDREB1D基因表達(dá)量均低于HWD處理。 HWD處理在7 ℃ 8.0 h（T7）時，MaDREB1D基因的表達(dá)量突然下降，究其原因可能是MaDREB1D基因在7 ℃ 4.0 h前表達(dá)被誘導(dǎo)增強(qiáng)，需要一段時間恢復(fù)，后期香蕉果實出現(xiàn)冷害癥狀從而再次誘導(dǎo)MaDREB1D基因的表達(dá)量逐漸上升?？梢?，EGTA可抑制由熱處理誘導(dǎo)的香蕉果實MaDREB1D基因上調(diào)表達(dá)。

2. 3 HWD處理和EGTA+HWD處理對香蕉果實MaDREB2C基因表達(dá)的影響

從圖3可知， HWD處理的MaDREB2C基因表達(dá)量在20 ℃ 0.5 h（T2）和7 ℃ 24.0 h（T8）時各出現(xiàn)一個高峰，其他時間點則維持在較低水平。而EGTA+HWD處理的MaDREB2C基因表達(dá)量僅在7 ℃ 48.0 h（T9）出現(xiàn)一個小高峰，其余時間點的表達(dá)量與20 ℃ 0 h（T1）差異不明顯?？傮w來看，在7 ℃ 1.0 h（T5）、48.0 h（T9）和120.0 h（T10）時，HWD處理和EGTA+HWD處理的MaDREB2C基因表達(dá)量基本一致，其他時間點EGTA+HWD處理的MaDREB2C基因表達(dá)量均較HWD處理低?？梢?，EGTA可抑制由熱處理誘導(dǎo)的香蕉果實MaDREB2C基因上調(diào)表達(dá)，并使其表達(dá)量一直維持在較低水平。

2. 4 HWD處理和EGTA+HWD處理對香蕉果實MaDREB3基因表達(dá)的影響

從圖4可知，HWD處理的MaDREB3基因表達(dá)量在7 ℃ 1.0 h（T5）時出現(xiàn)一個高峰，其余時間點均保持較低水平，而EGTA+HWD處理的MaDREB3基因表達(dá)量一直處于較低水平?？傮w來看，EGTA+HWD處理的MaDREB3基因表達(dá)量在大部分時間點均低于HWD處理。綜上所述，EGTA可抑制由熱處理誘導(dǎo)的香蕉果實MaDREB3基因上調(diào)表達(dá)，并使其表達(dá)量一直維持在較低水平。

2. 5 HWD處理和EGTA+HWD處理對香蕉果實MaCOR413基因的影響

從圖5可知，HWD處理的MaCOR413基因表達(dá)量在20 ℃ 0.5 h（T2）和7 ℃ 4.0 h（T6）時分別出現(xiàn)一個高峰，其他時間點則維持在較低水平;EGTA+HWD處理的MaCOR413基因表達(dá)量則一直維持在較低水平，且除20 ℃ 1.5 h（T3）和7 ℃ 120.0 h（T10）外，其他時間點均低于HWD處理?？梢?，EGTA可抑制由熱處理誘導(dǎo)的香蕉果實MaCOR413基因上調(diào)表達(dá)，并使其表達(dá)量一直維持在較低水平。

3 討論

CBF冷應(yīng)答途徑是植物產(chǎn)生抗冷性的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。受ICE（Inducer of CBF expression）調(diào)控的CBF能特異結(jié)合啟動子中含CRT/DRE的順式元件，激活下游一系列冷調(diào)節(jié)基因COR的表達(dá)，從而提高植物的抗寒性（Hadi et al.，2011;Wu et al.，2012;Chen et al.，2013）。擬南芥基因組CBF/DREB亞族分為6個亞類（A1～A6），本研究的MaDREB1D、MaDREB2C和MaDREB3基因分別屬于CBF/DREB轉(zhuǎn)錄因子A6、A3和A4亞類。

前人研究表明，熱處理是提高采后果實抗冷性的有效手段，如52 ℃熱處理香蕉果實3 min能有效減輕香蕉果實的冷害癥狀（Wang et al.，2008，2012;王海波等，2012）。本研究結(jié)果表明，熱處理后20 ℃貯藏0.5 h時香蕉果實MaDREB1D、MaDREB2C、MaDREB3和MaCOR413基因上調(diào)表達(dá)，當(dāng)香蕉果實在7 ℃冷藏時，這4個基因受熱處理誘導(dǎo)其表達(dá)量均不同程度上升。在其他采后果蔬中也有類似研究報道，如熱處理能誘導(dǎo)玉米ZmDREB2A基因（Qin et al.，2007）和蘋果MsDREB2C基因（Zhao et al.，2013）的表達(dá)上調(diào);35或45 ℃熱處理均能顯著提高獼猴桃果實AcCBF基因的表達(dá)量（Ma et al.，2014）。

本研究發(fā)現(xiàn)，與熱處理相比，EGTA結(jié)合熱處理能明顯抑制香蕉果實在20 ℃貯藏時的MaDREB1D、MaDREB2C和MaCOR413基因表達(dá)，但對MaDREB3基因表達(dá)的抑制效果不明顯;當(dāng)香蕉果實轉(zhuǎn)入7 ℃冷藏后，與熱處理相比，EGTA結(jié)合熱處理能明顯抑制MaDREB2C、MaDREB3和MaCOR413基因的表達(dá)，使其表達(dá)量一直處于較低水平。與熱處理相比，EGTA結(jié)合熱處理明顯抑制MaDREB1D基因在20 ℃ 0.5 h時的表達(dá)，也降低了MaDREB1D基因在7 ℃冷藏過程中的表達(dá)量?？傊?，EGTA有效抑制了香蕉果實CBF冷應(yīng)答途徑相關(guān)基因的表達(dá)。在其他作物中也有類似報道，竇海鷗（2014）用20 mmol/L EGTA和40 ℃熱激處理馬鈴薯幼苗能顯著抑制AtCBF3基因的表達(dá)，利用100 mmol/L CaCl2和40 ℃熱激處理馬鈴薯幼苗則能顯著上調(diào)其AtCBF3基因的表達(dá);于涌鯤等（2010）利用A23187和0.5～6.0 mmol/L EGTA處理菠菜幼苗能抑制其CBF基因表達(dá)，且EGTA處理濃度越高，CBF基因表達(dá)量越少;張國增等（2009）用20 mmol/L EGTA或10 mmol/L LaCl3處理擬南芥幼苗均能抑制4 ℃低溫誘導(dǎo)的胞質(zhì)Ca2+濃度升高，且CBF1超表達(dá)突變體和對照胞質(zhì)中的Ca2+濃度下降至同一水平，說明Ca2+參與擬南芥CBF1冷應(yīng)答途徑，CBF1超表達(dá)突變體可能是通過提高胞質(zhì)Ca2+濃度來提高植物的抗冷性。以上研究結(jié)果均說明鈣信號參與了CBF冷應(yīng)答途徑。

4 結(jié)論

EGTA能抑制香蕉果實CBF冷應(yīng)答途徑相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)，推測鈣信號可能參與香蕉果實CBF冷應(yīng)答途徑。

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