王少銘 侯穎輝 羅莉斯 冷家歸 李德文

摘要：【目的】研究薄荷種質(zhì)資源的遺傳多樣性及親緣關(guān)系，為薄荷地方種質(zhì)資源的收集、保護及材料創(chuàng)新提供參考?！痉椒ā拷Y(jié)合SRAP和ISSR標記對48份不同來源薄荷種質(zhì)材料的DNA進行多態(tài)性擴增，并根據(jù)擴增圖譜進行遺傳多樣性及聚類分析?！窘Y(jié)果】利用篩選的20對SRAP和ISSR引物從48份薄荷種質(zhì)材料分別擴增出187和183條條帶，多態(tài)性比率分別為97.33%和97.27%。48份薄荷種質(zhì)材料的平均Neis遺傳多樣性指數(shù)（H'）為0.1672，平均Shannons信息指數(shù)（I）為0.2762，說明供試薄荷種質(zhì)材料的遺傳多樣性較豐富。聚類分析結(jié)果顯示，48份薄荷種質(zhì)材料可分為五大類，其中I類又可分為5個亞類，該聚類結(jié)果主要由品種差異決定，受地域影響較小;在遺傳相似系數(shù)為0.76處可將33份貴州薄荷資源分為四大類。不同來源的薄荷群體遺傳多樣性排序為引進群體>貴州群體>重慶群體>云南群體，貴州群體與引進群體遺傳距離最大，與云南群體和重慶群體遺傳距離較小，說明貴州群體、云南群體和重慶群體親緣關(guān)系較近?！窘Y(jié)論】SRAP和ISSR標記對薄荷種質(zhì)材料的多態(tài)性檢出率較高。薄荷屬種間具有豐富的遺傳多樣性，但種內(nèi)遺傳變異較小。貴州薄荷種質(zhì)材料的遺傳基礎(chǔ)較引進材料狹窄，與云南和重慶的薄荷種質(zhì)材料遺傳背景較近。

關(guān)鍵詞： 薄荷;SRAP;ISSR;遺傳多樣性;親緣關(guān)系

中圖分類號： S567.235.024? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）11-2148-07

Genetic diversity and genetic relationship of Mentha L. germplasm resources based on SRAP and ISSR markers

WANG Shao-ming， HOU Ying-hui， LUO Li-si， LENG Jia-gui， LI De-wen*

（Institute of Oil Crops， Guizhou Academy of Agricultural Sciences， Guiyang? 550006， China）

Abstract：【Objective】This study was conducted to investigate the genetic diversity and genetic relationship of Mentha L. germplasm resources in order to provide reference for Mentha L. germplasm resources collection， protection and innovation. 【Method】The DNA of 48 samples of Mentha L. germplasm resource materials from different sources were conducted polymorphic amplification by SRAP and ISSR markers. Genetic diversity and cluster analysis were conducted on the basis of? amplification map. 【Result】A total of 187 and 183 bands were amplified respectively from 48 samples of Mentha L. germplasm resource materials by using 20 selected pairs of SRAP and ISSR primers. The polymorphic rates of SRAP and ISSR primers were respectively 97.33% and 97.27%. The average Neis genetic diversity index（H'） of 48 samples of Mentha L. germplasm resource materials was 0.1672 and the average Shannons information index（I） was 0.2762， indicating that the Mentha L. germplasm resource materials collected were relatively rich in genetic diversity. The result of cluster analysis indicated that 48 samples of Mentha L. germplasm resource materials could be divided into five categories， and category Ⅰ could be divided into five classes. The results of cluster analysis mainly depended on the difference of varieties and the influence of regional factor was small. Thirty-three? Mentha L. resources in Guizhou could be divided into four categories when genetic similarity coefficient was 0.76. Further studies showed that the genetic diversity level of different Mentha L. populations from different sources was manifested as introduced population>Guizhou population>Chongqing population>Yunnan population. The genetic distance between Guizhou population and introduced population was the largest while the genetic distances among Guizhou， Yunnan and Chongqing populations were small， indicating that the genetic relationships among Guizhou， Yunnan and Chongqing populations were close. 【Conclusion】The polymorphic detection rates of SRAP and ISSR molecular markers on Mentha L. germplasm resource materials are high. There is abundant genetic diversity among Mentha L. species，while the intra-species genetic variation is relatively small. The genetic basis of the Mentha L. germplasm resource materials in Guizhou is relatively narrow compared with the introduced germplasm resource materials. And the genetic background of Mentha L. germplasm resource materials in Guizhou is close to those in Yunnan and Chongqing.

Key words：? Mentha L.; SRAP; ISSR; genetic diversity; genetic relationship

0 引言

【研究意義】薄荷（Mentha haplocalyx Briq.）為唇形科（Labiatae）薄荷屬（Mentha L.）植物，是世界上主要的香料植物，也是一種常用的中藥材（房海靈等，2010）。薄荷的用途廣泛，從其莖和葉中提取的薄荷油、椒樣薄荷油、留蘭香油及經(jīng)加工得到的薄荷腦等已廣泛應用于醫(yī)藥、食品、化妝品、香料及煙草等領(lǐng)域（梁呈元，2009;國家藥典委員會，2015）。據(jù)《中國植物志》記載，我國有薄荷屬植物12種，其中野生薄荷6種，廣泛分布于全國各地，由于薄荷適應性強、有性和無性繁殖并存，自然雜交普遍導致很多生物性狀的變異，研究薄荷種質(zhì)資源的遺傳多樣性及親緣關(guān)系，對薄荷地方種質(zhì)資源的開發(fā)利用、保護及新品種選育具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前，有關(guān)薄荷的遺傳多樣性研究主要基于外部形態(tài)描述（朱梅等，2010）、染色體分型（于盱等，2009）、化學分型（陳小華，2013;楊倩，2017）等，但研究結(jié)果易受主觀、環(huán)境等因素影響。由于分子標記技術(shù)能準確有效地進行種質(zhì)資源鑒定和分析，已廣泛應用于油菜（Lombard et al.，2000）、玉米（Sun et al.，2001）、煙草（祁建民等，2012）、薄荷（王海棠等，2012）、生姜（李秀等，2014）、薏苡（夏法剛等，2017）等種質(zhì)鑒定和遺傳多樣性分析。Fenwick和Ward（2001）、房海靈等（2010）利用RAPD標記分析薄荷屬植物種源間的遺傳多樣性，結(jié)果表明薄荷屬植物種源間遺傳多樣性豐富，同一種類來源相同或相近的種源聚在一起，說明薄荷屬種內(nèi)的遺傳關(guān)系與地理分布和環(huán)境差異存在一定相關(guān)性。Gobert等（2002）利用AFLP標記對62份薄荷種質(zhì)資源進行聚類分析，結(jié)果表明這些種質(zhì)資源可明顯分為兩大類群。Shasany等（2005）利用AFLP標記對薄荷資源的親緣關(guān)系進行研究，結(jié)果表明，長葉薄荷（M. longifolia）與紅薄荷（M. gentilis）的親緣關(guān)系最近。樂云辰等（2008）利用ISSR標記對11個薄荷品種進行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，其遺傳多樣性較高，在遺傳相似系數(shù)0.42的水平上，可將其分為4個類群。梁呈元等（2011a，2011b）利用ISSR標記對我國薄荷屬7個種34個居群進行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明薄荷資源存在豐富的遺傳多樣性，薄荷居群間的遺傳變異大于居群內(nèi)的變異。陳小華（2013）利用AFLP標記對28份薄荷種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其遺傳相似系數(shù)為0.44～0.91，平均0.60，可分為7個類群。謝琳等（2013）利用ISSR標記對海南引種的14個薄荷種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，其存在豐富的遺傳變異。近5年鮮見利用分子標記研究薄荷遺傳多樣性和親緣關(guān)系的文獻報道?！颈狙芯壳腥朦c】目前，大量研究證實單一的分子標記技術(shù)存在局限性，結(jié)合多種標記可更全面、準確地揭示種質(zhì)遺傳特性。由于SRAP標記用于檢測基因編碼框（ORF）區(qū)域的多態(tài)性，ISSR標記用于檢測2個SSR間短DNA序列的多態(tài)性（祁建民等，2012），因此，綜合二者可全面獲取各種遺傳變異信息，更準確揭示薄荷資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系。我國貴州及西南地區(qū)薄荷資源豐富，但鮮見應用SRAP和ISSR標記分析薄荷種質(zhì)資源遺傳多樣性及親緣關(guān)系的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用SRAP和ISSR標記對來源不同的48份薄荷種質(zhì)資源進行遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析，為薄荷種質(zhì)資源的收集、保護及開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試的48份薄荷材料詳見表1。各材料種植于貴州省農(nóng)業(yè)科學院油料研究所香料試驗地。主要試劑：2×Taq PCR MasterMix購自北京艾德萊生物科技有限公司，DL1500 DNA Marker、瓊脂糖、30%聚丙烯酰胺、50×TAE Buffer等均購自寶生物工程（大連）有限公司。主要儀器：NanoDropTM ND-1000核酸蛋白測定儀（Thermo，美國）、C1000 Touch PCR儀（BIO-RAD，美國）、DYCZ-30C型雙板夾芯式垂直電泳儀和DYY-6C型雙穩(wěn)定時電泳儀電源（北京六一生物有限公司）。

1. 2 樣品采集

將48份薄荷種質(zhì)材料進行小區(qū)（面積1 m×2 m）種植，每小區(qū)種植8株，各小區(qū)設(shè)2個重復。在晴朗的上午分別取各材料的頂部嫩葉，每份種質(zhì)材料隨機取3株混合，裝于預冷的2 mL離心管，-80 ℃保存。

1. 3 DNA提取

采用改進的CTAB法提取DNA，在提取緩沖液中加入2% β-巰基乙醇和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）以除去酚類和多糖類物質(zhì)，分別采用1%瓊脂糖凝膠電泳和核酸/蛋白測定儀檢測DNA質(zhì)量和濃度，并稀釋至50 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 SRAP和ISSR分析

SRAP引物由中國農(nóng)業(yè)科學院油料研究所提供，其中正向引物36條，反向引物24條，可形成864對引物組合。ISSR引物為哥倫比亞大學（UBC）公布的100個引物序列，兩種引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。從上述引物中篩選出擴增條帶清晰、多態(tài)性豐富、穩(wěn)定的20對引物，其中SRAP和ISSR引物各10對，用于后續(xù)試驗，引物序列見表2和表3。PCR反應體系10.0 μL：2×Taq PCR MasterMix（含染料）5.0 μL、10 μmol/L正、反向引物各1.0 μL、50 ng/μL DNA模板0.5 μL，ddH2O補足至10.0 μL。每個PCR反應體系設(shè)2個重復。擴增程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 30 s，55～50 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，進行10個循環(huán);94 ℃ 1 min，50 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，進行30個循環(huán);72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，用銀染法顯色，然后拍照記錄。

1. 5 數(shù)據(jù)分析

觀察電泳圖譜，有條帶記為1，無條帶記為0。應用POPGENE 1.32計算多態(tài)性位點百分率，有效等位基因數(shù)（Ne）、Neis遺傳多樣性指數(shù)（H'）和Shannon信息指數(shù)（I）等，并利用NTSYS-pc 2.10e計算遺傳相似系數(shù)（GS），采用UPGMA（非加權(quán)組平均法）進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 薄荷種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析結(jié)果

利用篩選的10對SRAP引物對48份薄荷種質(zhì)材料進行PCR擴增，共擴增出187條條帶，平均每條引物擴增出18.7條;引物組合Me28/Em4擴增條帶數(shù)（28條）最多，引物組合Me34/Em6擴增條帶數(shù)（12條）最少（圖1），其中多態(tài)性條帶182條，多態(tài)性比率為97.33%。利用篩選的10個ISSR引物對48份薄荷種質(zhì)材料進行擴增，共擴增出183條條帶，平均每條引物擴增出18.3條，其中多態(tài)性條帶178條，多態(tài)性比率為97.27%（圖2）。可見，篩選的20對引物均具有較高的多態(tài)性檢出率，可利用特異帶型來區(qū)分不同的薄荷種質(zhì)資源。

利用POPGENE Version 1.32對薄荷種質(zhì)材料的遺傳相關(guān)參數(shù)進行計算分析，結(jié)果顯示，基于SRAP和ISSR標記分析獲得48份薄荷種質(zhì)材料的H'分別為0.1543和0.1803，I分別為0.2604和0.2923。綜合兩種分子標記的遺傳相關(guān)參數(shù)進行遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示，48份薄荷種質(zhì)材料的H'為0.1672，I為0.2762，說明供試薄荷種質(zhì)材料的遺傳多樣性較豐富。

2. 2 薄荷種質(zhì)資源的聚類分析結(jié)果

基于SARP和ISSR標記的多態(tài)性信息，應用NTSYS對48份薄荷種質(zhì)材料進行聚類分析，結(jié)果如圖3所示。當遺傳相似系數(shù)為0.73，可將薄荷資源分為五大類，Ⅰ類包括43份材料，包含所有的留蘭香、野生薄荷等資源;Ⅱ類包括2份材料，均為引進的薄荷資源;Ⅲ類為蘋果薄荷，Ⅳ類為香檳薄荷，Ⅴ類為普列薄荷。說明蘋果薄荷、香檳薄荷和普列薄荷與其他薄荷資源的親緣關(guān)系較遠，與形態(tài)標記的聚類分析結(jié)果（王少銘等，2018）一致。當遺傳相似系數(shù)為0.79，Ⅰ類資源又可分為5個亞類，其中Ⅰa類包括33份從各地收集的留蘭香和荷蘭薄荷，Ⅰb類包括所有的野生薄荷和蘇格蘭薄荷，Ⅰc類包括胡椒薄荷和來自四川的薄荷，Ⅰd類包括小葉留蘭香和普定薄荷，Ⅰe類僅包括來自興義的薄荷。可見，薄荷種質(zhì)資源聚類結(jié)果主要由品種差異決定，受地域影響較小。

2. 3 貴州薄荷種質(zhì)資源的遺傳多樣性及聚類分析結(jié)果

為進一步分析貴州薄荷種質(zhì)資源的多樣性，利用POPGENE Version 1.32對33份貴州薄荷種質(zhì)材料的SARP和ISSR標記多態(tài)性信息進行分析，結(jié)果顯示，SARP與ISSR標記的多態(tài)性比率為78.65%，平均H'為0.1424，平均I為0.2341，說明貴州薄荷種質(zhì)材料的遺傳基礎(chǔ)相對較窄，大部分材料親緣關(guān)系較近。應用NTSYS對其進行聚類分析，結(jié)果（圖4）顯示，在遺傳相似系數(shù)為0.76處，可將貴州薄荷資源分為四大類：i類包括28個材料，均為留蘭香;ii類包括2個材料，分別為小葉留蘭香和普定薄荷;iii類包括2個材料，均為野生薄荷;iv類只有1個材料，為來自興義的薄荷?？梢姡m然貴州薄荷資源遺傳多樣性較低，但能明顯分為4個種類，且該分子標記聚類結(jié)果和農(nóng)藝性狀聚類結(jié)果（王少銘等，2018）基本一致，表明二者均能將留蘭香、野生薄荷和小葉留蘭香區(qū)分開來。

2. 4 不同來源薄荷種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析結(jié)果

將48份薄荷材料按照不同來源分為4個群體，分別為貴州群體、重慶群體（包括四川的BH06材料）、云南群體和引進群體（具體來源不詳?shù)馁Y源），應用POPGENE Version 1.32對4個群體的SRAP和ISSR多態(tài)性條帶進行分析，結(jié)果（表4）顯示，引進群體的H'和I較高，分別為0.1680和0.2738;貴州群體的H?和I次之，分別為0.1450和0.2385;云南群體的H'和I較低，分別為0.0930和0.1404。因此，4個群體的遺傳多樣性排序為引進群體>貴州群體>重慶群體>云南群體。4個群體的遺傳一致度和遺傳距離如表5所示。貴州群體和云南群體的遺傳一致度最高，說明二者的遺傳背景最近;云南群體和引進群體的遺傳一致度最低，說明二者遺傳差異最大;貴州群體與引進群體遺傳距離最大，與云南群體和重慶群體遺傳距離較小，說明貴州群體、云南群體和重慶群體親緣關(guān)系較近。

3 討論

3. 1 薄荷資源遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析

本研究利用SRAP和ISSR兩種分子標記分析48份薄荷種質(zhì)資源，20對引物共擴增多態(tài)性條帶370條，平均每對引物擴增出18.5條，高于房海靈等（2010）利用RAPD標記平均每對引物擴增出的多態(tài)性條帶數(shù)（4.55條），表明SRAP和ISSR標記對薄荷種質(zhì)資源的多態(tài)性檢出率高于RAPD。SRAP和ISSR標記分析得到的48份薄荷資源的H'分別為0.1543和0.1803，I分別為0.2604和0.2923，表明雖然SRAP與ISSR標記的原理不一樣（邵珠田，2017），但對薄荷種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析結(jié)果基本一致。

本研究聚類分析結(jié)果表明，引進的薄荷資源顯著和其他薄荷資源區(qū)別開來，貴州的薄荷種質(zhì)資源主要以留蘭香類型為主，野生薄荷和小葉類型次之，還有遺傳距離較遠的興義薄荷類型，表明貴州省的薄荷種質(zhì)資源除前人報道（代正福和雷朝云，2001）的留蘭香和野生薄荷之外，還有其他類型的種質(zhì)資源，但要確定其遺傳地位還需進一步研究。

3. 2 不同來源地和薄荷資源種間遺傳分化

供試的48份薄荷種質(zhì)資源按來源地進行遺傳多樣性分析，4個群體的遺傳多樣性表現(xiàn)為引進群體>貴州群體>重慶群體>云南群體，貴州群體與引進群體遺傳距離最大，與云南群體和重慶群體遺傳距離較小，其原因是貴州、云南和重慶歸屬于我國西南地區(qū)，地理環(huán)境和氣候相似，薄荷種質(zhì)特性也較相似，遺傳多樣性相對較低，主要以留蘭香和野生薄荷為主，其中留蘭香被當作新鮮調(diào)味料使用，多為房前屋后零星種植，分布范圍廣，遺傳差異較小，遺傳基礎(chǔ)較狹窄，親緣關(guān)系較近，而引進群體來自地中海和歐洲地區(qū)，來源范圍廣，表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性，親緣關(guān)系較遠。因此，薄荷種質(zhì)資源的種間遺傳分化明顯，而同一種類不同來源地資源的遺傳分化較小。這與房海靈等（2010）應用RAPD標記分析薄荷屬（Mentha L.）7個種38個種源間的遺傳多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同一種類來源相同或相近的種源聚在一起的結(jié)果一致。

4 結(jié)論

SRAP和ISSR標記對48份薄荷種質(zhì)資源的多態(tài)性檢出率較高。薄荷屬種間具有豐富的遺傳多樣性，但種內(nèi)遺傳變異較小。與引進的薄荷資源相比，貴州的資源遺傳基礎(chǔ)相對較窄，與云南和重慶的資源親緣關(guān)系較近。

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