吳海霞 陳茹 曹雪梅 李歡 暴增海 馬桂珍 王軍強 羅志會

摘要：【目的】優(yōu)化海洋解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）GM-1-1的產芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基和搖瓶發(fā)酵條件，為該菌株的開發(fā)和應用提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳訥M-1-1菌株發(fā)酵液中的細菌總數(shù)和芽孢產率為檢測指標，采用單因素和正交試驗對該菌株產芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基和搖瓶發(fā)酵條件進行優(yōu)化;GM-1-1菌株發(fā)酵完成后噴霧干燥制成菌粉，加入不同助劑制成有效含量為1010 CFU/g的可濕性粉劑用于水稻紋枯病田間防治試驗。【結果】GM-1-1菌株產芽孢最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為麥麩0.75%、花生餅粉2.5%、CaCO3 0.05%;最佳發(fā)酵條件為pH 7，溫度30 ℃，250 mL三角瓶裝液量60 mL，接種量8%，轉速200 r/min，培養(yǎng)時間54 h。優(yōu)化后GM-1-1菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的細菌總數(shù)和芽孢產率分別達7.40×109個/mL和89.42%。田間防治試驗結果表明，GM-1-1可濕性粉劑對水稻紋枯病的防治效果最高可達82.06%?！窘Y論】優(yōu)化后的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件可有效提高GM-1-1菌株的細菌總數(shù)和芽孢產率，且培養(yǎng)基成本低、來源廣泛。GM-1-1可濕性粉劑對水稻紋枯病有較好的防治效果，可用于生產菌劑并推廣應用。

關鍵詞： 海洋解淀粉芽孢桿菌;GM-1-1菌株;芽孢;培養(yǎng)基;發(fā)酵條件;田間防治效果

中圖分類號： S476? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2018）12-2454-09

Optimization of fermentation medium for spore production and flask-shaking fermentation conditions of marine

bacteria GM-1-1

WU Hai-xia1， CHEN Ru1， CAO Xue-mei1， LI Huan1， BAO Zeng-hai1，

MA Gui-zhen1*， WANG Jun-qiang2， LUO Zhi-hui2

（1School of Marine Science and Technology， Huaihai Institute of Technology，Lianyungang， Jiangsu? 222005， China; 2Jiangsu Frey Agrochemicals Co.， Ltd.， Lianyungang， Jiangsu? 222005， China）

Abstract：【Objective】Fermentation medium for spore production and flask-shaking fermentation conditions of Baci-llus amyloliquefaciens GM-1-1 were optimized， in order to provide theoretical references for exploitation and application of GM-1-1 strain. 【Method】Total number of bacteria and spore production rate in fermentation broth of GM-1-1strain were set as test indexes. And fermentation medium for spore production and flask-shaking fermentation conditions of GM-1-1 strain were optimized by using single factor and orthogonal test. After the fermentation was finished， bacteria powder was made by spraying and dying. Then different promoters were added to make the wettable powder with effective content of 1010 CFU/g. The wettable powder was used to conduct field control test of rice sheath blight. 【Result】The results showed that the best formulation of fermentation medium for spore production of GM-1-1 strain was as follows：wheat bran 0.75%， peanut meal 2.5% and CaCO3 0.05% . The optimum fermentation conditions were as follows：pH 7， temperature 30 ℃， broth content 60 mL in 250 mL triangular flask， inoculation amount 8%， rotation speed 200 r/min and incubation time 54 h. After optimization， the total number of bacteria and spore production rate infermentation mediumof GM-1-1 strain reached 7.4×109 cells/mL and 89.42% respectively. The results of field control test showed that control efficacy of GM-1-1 wettable powder on rice sheath blight could be up to 82.06%. 【Conclusion】The optimized medium and fermentation conditions can effectively increase total number of bacteria and spore production rateof GM-1-1 strain， and the culture cost is low and with wide source. The control efficacy of GM-1-1 wettable powder on rice sheath blight is fine. Therefore， GM-1-1 can be used to produce bacterial agents and then be promoted and applied.

Key words： Bacillus amyloliquefaciens; GM-1-1 strain; spore; medium; fermentation conditions; field control effects

0 引言

【研究意義】水稻紋枯病是由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起的水稻三大重要病害之一，一般發(fā)病時可造成水稻減產10%～30%，嚴重時可達50%以上。目前生產中主要使用井岡霉素進行防治，農藥種類單一，一些地區(qū)的水稻紋枯病菌已出現(xiàn)了抗藥性（許麗娟等，2008）。因此，研究新型、高效、無毒的生物農藥豐富植物病害防治藥劑種類，避免長期使用單一藥劑帶來的副作用已成為當前植物病害防治研究的熱點。解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amylolique-faciens）是重要的農業(yè)生防菌，該菌可通過產生一系列抑制細菌和真菌的代謝物而達到防治植物病害的目的（Sutyak et al.，2008;王玲等，2014;饒勝其等，2015;李曉宇，2018）。美國、德國已將該菌制成不同制劑用于馬鈴薯黑痣病、黃瓜白粉病和稻瘟病等病害的防治，且已商品化（陳志誼，2015）。我國農業(yè)部于2013年為解淀粉芽孢桿菌頒發(fā)了100億活芽孢/g的母藥和10億活芽孢/g可濕性粉劑生產許可證，已有產品登記銷售，具有廣闊的開發(fā)應用前景。本研究旨在優(yōu)化源自海洋的解淀粉芽孢桿菌GM-1-1菌株的發(fā)酵條件，為該菌株制劑的研制提供參考?！厩叭搜芯窟M展】來源于不同生境的解淀粉芽孢桿菌菌株對營養(yǎng)及其環(huán)境要求不同，優(yōu)化適合特定菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基和條件是開發(fā)應用優(yōu)良菌株的基礎（趙志祥等，2015;武國慧等，2017）。不同學者采用單因素和正交試驗及Plackett-Burman和Box-Behnken試驗設計的響應曲面法分別對解淀粉芽孢桿菌的不同菌株液體發(fā)酵條件進行優(yōu)化，提高了發(fā)酵水平。郭龍濤等（2010）采用單因素試驗和正交試驗對內生解淀粉芽孢桿菌TB2菌株的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行優(yōu)化，優(yōu)化條件下發(fā)酵水平活菌數(shù)達8.52×1010 CFU/mL;蔣盼盼等（2016）采用單因子篩選和正交試驗對解淀粉芽孢桿菌菌株B1619的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，優(yōu)化后的生物發(fā)酵工藝獲得的發(fā)酵菌液含菌量為7.13×109 CFU/mL，比初始發(fā)酵工藝的發(fā)酵菌液含菌量提高了87.83%;王法國等（2017）通過單因素試驗及Plackett-Burman和Box-Behnken試驗設計的響應曲面法對解淀粉芽孢桿菌菌株JT84的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，優(yōu)化條件下發(fā)酵液芽孢含量為1.67×109 CFU/mL，較基礎培養(yǎng)基芽孢含量提高159%?！颈狙芯壳腥朦c】目前對解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵的優(yōu)化主要集中在抗菌物質的研究應用和提高單位體積發(fā)酵液活菌數(shù)量方面，對提高芽孢數(shù)量的研究報道較少?！緮M解決的關鍵問題】解淀粉芽孢桿菌GM-1-1菌株是本實驗室（抗菌微生物及其代謝產物研究與應用重點實驗室，下同）從連云港海域分離得到的一株對多種植物病原真菌有較強抑制作用、具有良好生防應用前景的優(yōu)良菌株（葛平華等，2012;王琦等，2016;曹雪梅等，2017）。本研究以GM-1-1菌株發(fā)酵液中的細菌總數(shù)和芽孢產率為檢測指標，通過單因素試驗和正交試驗，優(yōu)化GM-1-1菌株的培養(yǎng)基和搖瓶發(fā)酵條件，以期為該菌株的開發(fā)和應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 供試菌株 海洋解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）菌株GM-1-1由本實驗室從連云港海域中分離獲得并保藏;水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）由本實驗室保存并提供。

1. 1. 2 培養(yǎng)基 菌株活化培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基;菌株種子培養(yǎng)基：蛋白胨5 g/L、酵母膏1 g/L、葡萄糖5 g/L。

1. 2 種子液制備

取1環(huán)活化18 h的GM-1-1菌株接種于盛有60 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28 ℃ 180 r /min振蕩培養(yǎng)18 h，調整菌液濃度為108個/mL，作為發(fā)酵用種子液。

1. 3 搖瓶發(fā)酵初始條件

將種子培養(yǎng)液按10%的接種量接種到裝有60 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，pH 7.0、28 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)54 h。

1. 4 測定項目及方法

參考沈萍和陳向東（2007）采用血球計數(shù)板法測定細菌總數(shù)。參考陳美娜等（2013）采用結晶紫染色法測定芽孢產率。

1. 5 培養(yǎng)基的優(yōu)化試驗

1. 5. 1 基礎培養(yǎng)基篩選 將GM-1-1菌株在不同的培養(yǎng)基（表1）中按初始發(fā)酵條件進行發(fā)酵培養(yǎng)，以細菌總數(shù)和芽孢產率為指標，選擇細菌總數(shù)和芽孢產率較高的培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基優(yōu)化的基礎培養(yǎng)基。

1. 5. 2 培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗 選擇8種碳源（蔗糖、棉子糖、玉米粉、淀粉、葡萄糖、乳糖、麥麩和麥芽糖），7種氮源（胰蛋白胨、脲、硫酸銨、酵母粉、牛肉膏、花生餅粉和豆餅粉），10種無機鹽（K2HPO4、KH2PO4、ZnSO4、MgCl2、MnSO4、CaCO3、CaCO3+MnSO4、CaCO3+MgCl2、CaCO3+MnSO4+MgCl2和MnSO4+MgCl2），分別等量代替篩選出的基礎培養(yǎng)基中的碳源、氮源和無機鹽，配制不同發(fā)酵培養(yǎng)基進行GM-1-1菌株發(fā)酵培養(yǎng)，根據(jù)發(fā)酵液中細菌總數(shù)和芽孢產率篩選出最適碳源、氮源和無機鹽種類。

設置篩選出的碳源、氮源和無機鹽的不同濃度分別進行GM-1-1菌株發(fā)酵試驗，篩選出碳源、氮源和無機鹽的適宜濃度。

1. 5. 3 培養(yǎng)基優(yōu)化的正交試驗 根據(jù)單因素試驗篩選出的培養(yǎng)基最佳碳源、氮源和無機鹽種類和濃度，按正交試驗L9（33）設計（表2）配制不同培養(yǎng)基進行GM-1-1菌株發(fā)酵試驗，確定最佳培養(yǎng)基配方。

1. 6 發(fā)酵條件優(yōu)化試驗

以優(yōu)化的培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，分別測定不同初始pH（5、6、7、8和9）、發(fā)酵時間（0～60 h，每間隔4 h為一時間梯度，產芽孢后每隔2 h為一時間梯度）、裝液量（30、50、60、70、90、110和250 mL）、溫度（24、26、28、30和32 ℃）、接種量（5%、8%、10%、12%和15%）和搖床轉速（140、160、180、200和220 r/min）對GM-1-1菌株細菌總數(shù)和芽孢產率的影響。以初始發(fā)酵條件為基礎，每一因素的優(yōu)化均在前一因素優(yōu)化的基礎上進行。

1. 7 GM-1-1可濕性粉劑對水稻紋枯病的田間防治試驗

按照上述篩選的發(fā)酵培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件進行GM-1-1菌株發(fā)酵，發(fā)酵完成后噴霧干燥制成菌粉，加入不同助劑（硅藻土和硬脂酸鈣等）制成有效含量為1010 CFU/g的可濕性粉劑，在水稻紋枯病發(fā)病前或發(fā)病初期均勻噴霧于水稻莖基部，每隔7 d用藥1次，連續(xù)用藥3次，最后一次噴藥7 d后調查發(fā)病率，收獲時測定產量，計算防病效果和保產率。田間試驗在江蘇省連云港市東?？h石榴鎮(zhèn)進行，采用隨機區(qū)組設計，每小區(qū)面積25 m2，可濕性粉劑設450、600、750、900 和1050 g/ha 5個濃度，以20%井崗霉素水劑為對照CK1，清水為對照CK2，每一濃度及對照為一處理，3次重復。

發(fā)病率（%）=發(fā)病數(shù)/調查總數(shù)×100

保產率（%）=（處理產量-清水對照產量）/清水

對照產量×100

防治效果（%）=（清水對照發(fā)病率-處理發(fā)病率）/

清水對照發(fā)病率×100

1. 8 統(tǒng)計分析

采用Excel 2007和SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，以Duncans進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2. 1 培養(yǎng)基的優(yōu)化

2. 1. 1 基礎培養(yǎng)基篩選結果 由圖1可知，5種供試培養(yǎng)基中C號培養(yǎng)基發(fā)酵液中的細菌總數(shù)和芽孢產率最高，分別為4.04×109個/mL和82.73%，顯著高于其他基礎培養(yǎng)基處理（P<0.05，下同）;其次是D號培養(yǎng)基，細菌總數(shù)和芽孢產率分別為3.6×109個/mL和73.62%;培養(yǎng)基A和E不產芽孢。因此，選取C號培養(yǎng)基為GM-1-1菌株產芽孢的基礎培養(yǎng)基。

2. 1. 2 培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗結果

2. 1. 2. 1 碳源 由圖2可知，以7號麥麩為碳源的培養(yǎng)基發(fā)酵液中細菌總數(shù)和芽孢產率最高，分別為3.65×109個/mL和85.74%，顯著高于其他碳源培養(yǎng)基處理;以4號淀粉為碳源的培養(yǎng)基發(fā)酵液中細菌總數(shù)最少，為2.29×109個/mL，說明GM-1-1菌株在生長過程中不能很好地利用淀粉。因此，選擇麥麩作為GM-1-1菌株產芽孢培養(yǎng)基的碳源。

由圖3可知，麥麩濃度為0.50%時發(fā)酵液中的細菌總數(shù)和芽孢產率均達最高值，分別為3.80×109個/mL和85.71%;當濃度低于或高于0.50%時，發(fā)酵液中的細菌總數(shù)和芽孢產率均有所下降。因此，選擇0.25%、0.50%和0.75%作為正交試驗碳源濃度的3個水平。

2. 1. 2. 2 氮源 由圖4可知，以5號牛肉膏為氮源的發(fā)酵液中細菌總數(shù)最高，為5.58×109個/mL，顯著高于其他氮源發(fā)酵液中的細菌總數(shù)，但不產生芽孢;其次是6號花生餅粉為氮源的培養(yǎng)基，細菌總數(shù)為3.81×109個/mL，芽孢產率最高，為87.10%;2、3和5號氮源的發(fā)酵液均不產生芽孢。因此，選擇6號花生餅粉作為GM-1-1菌株產芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源。

由圖5可知，花生餅粉濃度對GM-1-1菌株發(fā)酵液的細菌總數(shù)和芽孢產率有明顯影響，花生餅粉濃度為2.5%時細菌總數(shù)和芽孢產率均達最高值，分別為3.80×109個/mL和86.30%;濃度高于或低于2.5%時發(fā)酵液中的細菌總數(shù)和芽孢產率均有所降低。因此，選擇2.0%、2.5%和3.0%作為正交試驗氮源花生餅粉濃度的3個水平。

2. 1. 2. 3 無機鹽 由圖6可知，添加7號CaCO3和4號ZnSO4發(fā)酵液處理中的芽孢產率顯著高于其他無機鹽發(fā)酵液，芽孢產率分別為88.15%和89.44%，二者間無顯著差異（P>0.05，下同），但4號ZnSO4發(fā)酵液中的細菌總數(shù)最少，僅1.64×109個/mL，而7號CaCO3發(fā)酵液中細菌總數(shù)最高，為4.68×109個/mL，顯著高于其他處理;添加其余幾種無機鹽的發(fā)酵液中細菌總數(shù)均較低。因此，選擇CaCO3為GM-1-1菌株產芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基的無機鹽。

由圖7可知，CaCO3濃度為0.10%時發(fā)酵液中的細菌總數(shù)和芽孢產率均達最高值，分別為3.95×109個/mL和81.08%;濃度低于或高于0.10%時發(fā)酵液中的細菌總數(shù)和芽孢產率均明顯下降。因此，選擇0.05%、0.10%和0.20%作為正交試驗無機鹽濃度的3個水平。

2. 1. 3 培養(yǎng)基優(yōu)化的正交試驗結果 正交試驗結果（表2）表明，氮源花生餅粉（B）對細菌總數(shù)的影響最大，其次為無機鹽CaCO3（C）、碳源麥麩（A），即B>C>A，對應的最佳組合為A3B2C1;碳源麥麩（A）對芽孢產率的影響最大，其次是無機鹽CaCO3（C）、氮源花生餅粉（B），即A>C>B，對應的最佳組合為A3B2C2。8號試驗A3B2C1培養(yǎng)基中的細菌總數(shù)和產芽胞率最高，分別為5.90×109個/mL和88.78%，顯著高于其他試驗組合，因此確定產芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：麥麩0.75%、花生餅粉 2.5%、CaCO3 0.05%。

2. 2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2. 2. 1 pH pH對GM-1-1菌株的細菌總數(shù)和芽孢產率有顯著影響，在pH為5～7時細菌總數(shù)和芽孢產率均隨pH增大而增加，pH為7時細菌總數(shù)和芽孢產率均最高，分別為5.75×109個/mL和90.92%，當pH大于7時，細菌總數(shù)和芽孢產率均明顯下降，說明中性條件適合GM-1-1菌株生長。因此，選擇pH 7為GM-1-1菌株搖瓶產芽孢發(fā)酵的最佳pH。

2. 2. 2 發(fā)酵時間 由圖9可知，發(fā)酵時間對GM-1-1菌株的細菌總數(shù)和芽孢產率有明顯影響，在0～20 h內細菌總數(shù)增長緩慢，20 h后細菌總數(shù)快速增加，20～28 h為對數(shù)期，28 h開始進入穩(wěn)定期，細菌總數(shù)增加緩慢，芽孢開始形成，32 h后產芽孢率快速增加，40 h細菌總數(shù)最高，為6.95×109個/mL，54 h芽孢產率達最高值，為91.81%，其后細菌總數(shù)開始下降，進入衰退期。因此，選擇54 h為GM-1-1菌株搖瓶產芽孢發(fā)酵的最佳發(fā)酵時間。

2. 2. 3 裝液量 由圖10可知，在250 mL三角瓶中，裝液量為30～60 mL/時，隨裝液量的增加，發(fā)酵液中的細菌總數(shù)和芽孢產率呈上升趨勢，裝液量在60 mL時發(fā)酵液的細菌總數(shù)和芽孢產率均最高，分別為5.95×109個/mL和87.37%;裝液量大于60 mL后細菌總數(shù)明顯下降。因此，選擇60 mL為GM-1-1菌株搖瓶產芽孢發(fā)酵的最佳裝液量。

2. 2. 4 接種量 由圖11可知，接種量為5%～8%時，GM-1-1菌株發(fā)酵液的細菌總數(shù)和芽孢產率呈上升趨勢，8%時達最高值，細菌總數(shù)和芽孢產率分別為6.30×109個/mL和87.25%;接種量超過8%后，細菌總數(shù)和芽孢產率均減少。因此，選擇8%為GM-1-1菌株搖瓶產芽孢發(fā)酵的最佳接種量。

2. 2. 5 發(fā)酵溫度 由圖12可知，在24～30 ℃時，GM-1-1菌株發(fā)酵液中的細菌總數(shù)和芽孢產率均呈上升趨勢，30 ℃時細菌總數(shù)和芽孢產率均達最高值，分別為7.20×109個/mL和88.34%，超過30 ℃細菌總數(shù)和芽孢產率均明顯下降。因此，選擇30 ℃作為GM-1-1菌株搖瓶產芽孢發(fā)酵的最佳溫度。

2. 2. 6 搖床轉速 由圖13可知，當搖床轉速為140～200 r/min時，隨著轉速增大，GM-1-1菌株發(fā)酵液中的細菌總數(shù)和芽孢產率均呈上升趨勢，在200 r/min時細菌總數(shù)最高，達7.40×109個/mL，芽孢產率為89.42%;在轉速為220 r/min時芽孢產率最大，為92.08%，但可能搖床轉速太快導致菌體自溶，其細菌總數(shù)較低，僅為3.20×109個/mL。綜合考慮，選擇200 r/min作為GM-1-1菌株搖瓶產芽孢發(fā)酵最佳搖床轉速。

2. 3 GM-1-1可濕性粉劑對水稻紋枯病的田間防治效果

由表3可知，GM-1-1可濕性粉劑對水稻紋枯病有明顯的防治作用，用藥量為750 g/ha時水稻產量最高，為8323.5 kg/ha;用藥量為1050 g/ha時對水稻紋枯病的防治病效果最好，為82.06%。GM-1-1可濕性粉劑用藥量不同，防病效果和產量稍有不同，但各處理組的水稻產量和對水稻紋枯病的防治效果均與噴霧20%井岡霉素水劑（CK1）處理組的水稻產量和防治效果相當，因此，田間可使用GM-1-1可濕性粉劑防治水稻紋枯病。

3 討論

芽孢是產芽孢細菌在生長過程中形成的一種抗逆休眠體，芽孢的形成受營養(yǎng)物質和環(huán)境等因素的綜合影響（郭威等，2017;王繼雯等，2017）。芽孢產率是衡量生防菌劑品質的關鍵指標（鄭雙鳳，2017），通過優(yōu)化培養(yǎng)基和發(fā)酵條件可提高產芽孢細菌的芽孢產率和細菌總數(shù)，為工業(yè)化擴大生產、開發(fā)生防菌劑提供保障。

本研究結果表明，麥麩作為碳源對源于海洋的解淀粉芽孢桿菌GM-1-1菌株的細胞總數(shù)和芽孢形成有利，與王繼雯等（2014）對巨大芽孢桿菌C2的研究結果一致，且麥麩廉價易得，成本低，適合工業(yè)上大批量發(fā)酵。本研究中，GM-1-1菌株在以花生餅粉為氮源的培養(yǎng)基上細菌總數(shù)和芽孢產率較高，與劉寬博等（2016）對枯草芽孢桿菌C3的研究結果一致;而添加其他氮源（硫酸銨和脲）不利于GM-1-1菌株細菌總數(shù)的增加和芽孢形成，說明無機氮源不適宜其生長及形成芽孢;添加速效氮源（胰蛋白胨）的芽孢形成率明顯低于長效氮源（花生餅粉和豆餅粉），與郭榮君等（2005）報道的速效氮源對生防菌BH1菌株芽孢形成效果較差相一致。Posada-Uribe等（2015）研究表明添加無機鹽可提高枯草芽孢桿菌EA-CB0575的芽孢產率;李文哲等（2017）研究發(fā)現(xiàn)添加鈣離子可提高枯草芽孢桿菌D1的芽孢產率;本研究亦發(fā)現(xiàn)添加鈣離子可促進芽孢生成。相關研究表明，大多數(shù)鈣離子與芽孢所特有的化學成分吡啶二羧酸相結合，形成的鈣—吡啶二羧酸復合物約占芽孢干重的10%，復合物通過降低芽孢水含量而增加芽孢的抗逆性（郭夏麗等，2012）。

本研究按照優(yōu)化的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件發(fā)酵GM-1-1菌株后噴霧干燥制成菌粉，添加不同載體助劑制成含量為1010 CFU/g的GM-1-1可濕性粉劑，對水稻紋枯病的田間防治效果最高可達82.06%，與20%井岡霉素水劑的防治效果相當，且用該菌粉后水稻產量有一定的增加，表明該菌株具有良好的應用前景。為提高該菌株的防病效果，今后將進一步開展菌藥混配方面的研究，為實際生產應用提供理論依據(jù)。

4 結論

GM-1-1菌株產芽孢最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為麥麩0.75%、花生餅粉2.5%、CaCO3 0.05%;最佳發(fā)酵條件為pH 7，溫度30 ℃，250 mL三角瓶裝液量60 mL，接種量8%，轉速200 r/min，培養(yǎng)時間54 h。優(yōu)化后的培養(yǎng)基成本低，來源廣泛，適合工業(yè)上大批量發(fā)酵，可采用GM-1-1菌株生產菌劑并推廣應用。

參考文獻：

曹雪梅，汪晶晶，賈杰，李歡，王軍強，王琦，馬桂珍，暴增海. 2017. 海洋細菌GM-1-1菌株搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 食品科技，42（6）：23-29. [Cao X M，Wang J J， Jia J，Li H，Wang J Q，Wang Q，Ma G Z，Bao Z H. 2017. Optimization of fermentation medium components and cultural conditions for marine bacteria GM-1-1 in flask[J]. Food Science and Technology，42（6）：23-29.]

陳美娜，谷平平，羅丹. 2013. 微量元素Mn離子對DY芽孢桿菌芽孢形成影響的研究[J]. 中國微生態(tài)學雜志，25（12）：1369-1372. [Chen M N，Gu P P，Luo D. 2013. Study of trace element Mn ions influence on DY balluces spores formation[J]. Chinese Journal of Microecology，25（12）：1369-1372.]

陳志誼. 2015. 芽孢桿菌類生物殺菌劑的研發(fā)與應用[J]. 中國生物防治學報，31（5）：723-732. [Chen Z Y. 2015. Research and application of bio-fungicide with Bacillus spp.[J]. Chinese Journal of Biological Control，31（5）：723-732.]

葛平華，馬桂珍，付泓潤，王淑芳，劉兆普. 2012. 海洋解淀粉芽孢桿菌GM-1菌株發(fā)酵液抗菌譜及穩(wěn)定性測定[J]. 農藥，51（10）：731-732. [Ge P H，Ma G Z，F(xiàn)u H R，Wang S F， Liu Z P. 2012. The inhibitory spectrum and stability determination of marine Bacillus amyloliquefaciens GM-1 strain[J]. Agrochemicals，51（10）：731-732.]

郭龍濤，邱思鑫，蔡學清，胡方平. 2010. 內生解淀粉芽孢桿菌TB2液體發(fā)酵條件的研究[J]. 熱帶作物學報，31（2）： 259-264. [Guo L T， Qiu S X， Cai X Q， Hu F P. 2010. Optimization of conditions for liquid fermentation of endophytic Bacillus amyloliquefaciens TB2[J]. Chinese Journal of Tropical Crops，31（2）： 259-264.]

郭榮君，王步云，李世東. 2005. 營養(yǎng)對生防菌株BH1芽孢產量的影響研究[J]. 植物病理學報，35（3）： 283-285. [Guo R J，Wang B Y，Li S D. 2005. Nutrition requirements for spore formation by Bacillus licheniformis isolate BH1[J]. Acta Phytopathologica Sinica，35（3）： 283-285.]

郭威，郭曉軍，武紅敏，董麗華，朱寶成. 2017. 青貯用產纖維素酶菌株3X-10的產芽孢條件優(yōu)化[J]. 中國飼料，（10）： 23-27. [Guo W，Guo X J，Wu H M，Dong L H，Zhu B C. 2017. Spore production optimization of strain 3X-10 producing cellulase used for silage[J]. China Feed，（10）： 23-27.]

郭夏麗，狄源寧，王巖. 2012. 枯草芽孢桿菌產芽孢條件的優(yōu)化[J]. 中國土壤與肥料，（3）：99-103. [Guo X L，Di Y N， Wang Y. 2012. Optimization of sporulation conditions of Bacillus subtilis[J]. Soil and Fertilizer Sciences in China，（3）： 99-103.]

蔣盼盼，陳志誼，仲毅，韓競儀，戴秀華，劉永鋒，陸凡. 2016. 解淀粉芽孢桿菌B1619生物搖瓶發(fā)酵工藝的正交優(yōu)化[J]. 中國生物防治學報，32（2）： 221-228. [Jiang P P， Chen Z Y，Zhong Y，Han J Y，Dai X H，Liu Y F，Lu F. 2016. Optimization of the fermentation process of Baci-llus amyloliquefaciens B1619 via orthogonal method[J]. Chinese Journal of Biological Control，32（2）：221-228.]

李文哲，王金秋，范金霞，殷麗麗，馬依文，李澤. 2017. 牛糞沼液對枯草芽孢桿菌產孢影響[J]. 東北農業(yè)大學學報，48（4）：53-60. [Li W Z，Wang J Q，F(xiàn)an J X，Yin L L，Ma Y W， Li Z. 2017. Effect of biogas slurry of cow dung on spore production for Bacillus subtilis[J]. Journal of Northeast Agricultural University，48（4）： 53-60.]

李曉宇. 2018. 解淀粉芽孢桿菌LXY-6-2篩選、鑒定、誘變與發(fā)酵條件優(yōu)化及其對辣椒根腐病的生物防治研究[D]. 楊凌：西北農林科技大學. [Li X Y. 2018. Screening， identification， mutation and optimization of fermentation conditions of Bacillus amyloliguefaciens LXY-6-2 and its biocontrol effects against fusarium solani[D].Yangling：Northwest A&F University.]

劉寬博，謝遠紅，熊利霞，劉慧，張紅星. 2016. 一株產抗單增李斯特菌細菌素的枯草芽孢桿菌C3產芽孢條件的優(yōu)化[J]. 飼料研究，（7）： 45-50. [Liu K B，Xie Y H，Xiong L X，Liu H，Zhang H X. 2016. Optimization of spore production conditions of Bacillus subtilis C3 producing resistance to Listeria monocytogenes[J]. Feed Research，（7）：45-50.]

饒勝其，陳素雅，魏永峰，高璐，尹永祺，楊振泉，方維明. 2015. 解淀粉芽孢桿菌F1對黃曲霉的拮抗條件優(yōu)化及其抑霉特性研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，41（12）：6-12. [Rao S Q，Chen S Y，Wei Y F，Gao L，Yin Y Q，Yang Z Q， Fang W M. 2015. Condition optimization for antagoni-zing of Bacillus amyloliquefaciens F1 against Aspergillus flavus and its mycostatic properties[J]. Food and Fermentation Industries， 41（12）： 6-12.]

沈萍，陳向東. 2007. 微生物學實驗[M]. 北京：高等教育出版社. [Shen P， Chen X D. 2007. Experiment of Microbio-logy[M]. Beijing： Higher Education Press.]

王法國，張榮勝，劉永鋒，陸凡. 2017. 生防菌解淀粉芽孢桿菌JT84發(fā)酵工藝優(yōu)化[J]. 江蘇農業(yè)學報，33（1）： 73-80.[Wang F G， Zhang R S， Liu Y F， Lu F. 2017. Optimization of fermentation process of biocontrol agent Bacillus amyloliquefaciens JT84[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，33（1）：73-80.]

王繼雯，劉瑩瑩，李冠杰，劉莉，甄靜，鞏濤，楊文玲，岳丹丹，慕琦，陳國參. 2014. 巨大芽孢桿菌C2產芽孢培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J]. 中國農學通報，30（36）：155-160. [Wang J W， Liu Y Y，Li G J， Liu L，Zhen J，Gong T，Yang W L， Yue D D，Mu Q，Chen G S. 2014. Optimization of Spore Culture Conditions for Bacillus megaterium C2[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin，30（36）：155-160.]

王繼雯，岳丹丹，趙俊杰，劉莉，慕琦，李冠杰，甄靜，鞏濤，楊文玲，杜志敏，陳國參. 2017. 兩株芽孢桿菌混菌發(fā)酵產芽孢條件的優(yōu)化[J]. 中國釀造，36（5）： 95-99. [Wang J W，Yue D D，Zhao J J，Liu L，Mu Q，Li G J，Zhen J， Gong T，Yang W L，Du Z M，Chen G S. 2017. Optimization of spore-producing conditions of two Bacillus spp. mixed fermentation[J]. China Brewing，36（5）： 95-99.]

王玲，劉二明，周鑫鈺，任佐華，陳娟芳. 2014. 一株辣椒青枯病菌拮抗內生細菌的篩選鑒定與發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 南方農業(yè)學報，45（10）：1781-1787. [Wang L， Liu E M， Zhou X Y， Ren Z H， Chen J F. 2014. Isolation and identification of an antagonistic endophytic bacteria strain against Ralstonia solanacearum in pepper and its optimal fermentation conditions[J]. Journal of Southern Agriculture，45（10）：1781-1787]

王琦，汪晶晶，顧春霞，賈寶芝，王軍強，馬桂珍，暴增海，江淑娟，王淑芳. 2016. 兩株抗菌海洋細菌對白色念珠菌的抗菌作用穩(wěn)定性研究[J]. 藥物生物技術，23（3）： 226-230.[Wang Q， Wang J J， Gu C X， Jia B Z， Wang J Q， Ma G Z， Bao Z H， Jiang S J， Wang S F. 2016. The studies on the stability of the antibacterial activity of two marine bacteria strains against Candida albicans[J]. Pharmaceutical Biotechnology，23（3）： 226-230.]

武國慧，張蕾，高德才，李鵬程，張鷹，石元亮. 2017. 枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產聚-γ-谷氨酸的條件優(yōu)化[J]. 食品研究與開發(fā)，38（11）：165-170. [Wu G H，Zhang L，Gao D C， Li P C，Zhang Y，Shi Y L. 2017. Optimization of fermentation conditions of poly-γ-glutamic acid production by Bacillus subtilis[J]. Food Research and Development，38（11）：165-170.]

許麗娟，劉冬華，劉紅，汪彬，張愛群. 2008. 我國微生物農藥的應用現(xiàn)狀及發(fā)展前景[J]. 農藥研究與應用，12（1）： 9-11. [Xu L J，Liu D H，Liu H，Wang B，Zhang A Q. 2008. The current application status and development of microbial pesticide in China[J]. Agrochemicals Research & Application，12（1）： 9-11.]

趙志祥，嚴婉榮，陳圓，肖彤斌，肖敏. 2015. 一株生姜青枯病拮抗菌的篩選、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 南方農業(yè)學報，46（3）：421-427. [Zhao Z X，Yan W R，Chen Y， Xiao T B，Xiao M. 2015. Screening，identification and fermentation condition optimization of biocontrol bacteria YA-1 against ginger bacterial wilt[J]. Journal of Southern Agriculture，46（3）：421-427.]

鄭雙鳳，譚武貴，豐來，羅志威，徐滔明，張冬雪，譚石勇. 2017. 枯草芽孢桿菌NTGB-178高產芽孢發(fā)酵工藝優(yōu)化[J]. 南京農業(yè)大學學報，40（6）： 1031-1040. [Zheng S F，Tan W G，F(xiàn)eng L，Luo Z W，Xu T M，Zhang D X， Tan S Y. 2017. Optimization of sporulation fermentation process of Bacillus subtilis NTGB-178[J]. Journal of Nanjing Agricultural University，40（6）： 1031-1040. ]

Posada-Uribe L F，Romero-Tabarez M，Villegas-Escobar V. 2015. Effect of medium components and culture conditions in Bacillus subtilis EA-CB0575 spore production[J]. Bioprocess and Biosystems，38（10）： 1879-88.

Sutyak K E，Wirawan R E，Aroutcheva A A，Chikindas M L.2008. Isolation of the Bacillus subtilis antimicrobial peptide subtilosin from the dairy product-derived Bacillus amyloliquefaciens[J]. Journal of Applied Microbiology， 105（6）： 1067-1074.