柴貝貝　姜維佳　王莉貞　胡梅　趙雨川　吳永繼　司紅彬

摘要：[目的]探討原兒茶酸或綠原酸與抗菌藥聯(lián)用對(duì)魚(yú)源鏈球菌的抑菌效果，為魚(yú)源鏈球菌病的綜合防治提供參考依據(jù)。[方法]采用微量二倍稀釋法測(cè)定原兒茶酸、綠原酸及各種抗菌藥對(duì)魚(yú)源鏈球菌的最小抑菌濃度（MIC），并以1/2MIC的原兒茶酸或綠原酸分別聯(lián)合抗菌藥誘導(dǎo)魚(yú)源鏈球菌進(jìn)行傳代培養(yǎng)，然后使用微量棋盤(pán)稀釋法測(cè)定原兒茶酸或綠原酸與抗菌藥聯(lián)合作用后的部分抑菌濃度指數(shù)（FICI）。[結(jié)果]原兒茶酸和綠原酸對(duì)魚(yú)源鏈球菌的MIC分別為2500和16000μg/mL，以1250μg/mL的原兒茶酸和3000μg/mL的綠原酸分別與痢菌凈、阿米卡星、粘菌素、磺胺間甲氧嘧啶鈉、克林沙星和磷霉素等抗菌藥聯(lián)合誘導(dǎo)魚(yú)源鏈球菌傳代后，除磺胺間甲氧嘧啶鈉外，其他5種抗菌藥對(duì)傳代獲得菌株的MIC明顯降低。原兒茶酸與抗菌藥配伍后的FICI分別為0.500、0.750、0.516、1.125、0.140和10.516，綠原酸與抗菌藥配伍后的FICI分別為0.501、0.625、0.501、>2.000、0.140和10.501。依據(jù)FICI的判定標(biāo)準(zhǔn)可知，原兒茶酸與痢菌凈和克林沙星配伍呈協(xié)同效應(yīng)，與阿米卡星、粘菌素和磷霉素配伍呈相加效應(yīng)，與磺胺間甲氧嘧啶鈉配伍表現(xiàn)為無(wú)關(guān)效應(yīng)；綠原酸與阿米卡星和克林沙星配伍呈協(xié)同效應(yīng)，與痢菌凈、粘菌素和磷霉素配伍呈相加效應(yīng)，與磺胺間甲氧嘧啶鈉配伍則呈拮抗效應(yīng)。[結(jié)論]原兒茶酸或綠原酸與抗菌藥配伍后能增強(qiáng)大部分抗菌藥對(duì)魚(yú)源鏈球菌的抑菌活性，呈協(xié)同或相加作用，可在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：魚(yú)源鏈球菌；原兒茶酸；綠原酸；聯(lián)用；最小抑菌濃度（MIC）；部分抑菌濃度指數(shù)（FICI）

中圖分類(lèi)號(hào)：S941.42 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2018）03-0580-06

0引言

[研究意義]當(dāng)前的水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)雖已取得長(zhǎng)足發(fā)展和明顯成效，但魚(yú)源鏈球菌病的防控技術(shù)尚未得到突破，仍是制約魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的主要病害之一（楊劍等，2015；呂小麗等，2017；辛年香和蔡延渠，2017）。據(jù)報(bào)道，2012年僅因鏈球菌病給羅非魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失就超過(guò)10億元（李莉萍等，2013）。目前，在魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖生產(chǎn)中仍以化學(xué)類(lèi)抗菌藥防控魚(yú)源鏈球菌病為主，但這些廣譜抗菌藥的長(zhǎng)期大量使用，極易促使病原菌的耐藥性增強(qiáng)，進(jìn)而對(duì)生態(tài)環(huán)境及人類(lèi)健康產(chǎn)生極大的負(fù)面影響。因此，尋找一種既能有效防控魚(yú)源鏈球菌病又能減輕對(duì)環(huán)境破壞的方法顯得尤為重要。[前人研究進(jìn)展]魚(yú)源鏈球菌病是一種由鏈球菌感染引起的疾病，其病原菌包括海豚鏈球菌（Streptococcus iniae）、無(wú)乳鏈球菌（&agalactiae）、副乳房炎鏈球菌（S.parau-beris）和停乳鏈球菌（S. dysgalactiae）等（陳明，2013；郭長(zhǎng)明等，2017）。由于魚(yú)源鏈球菌病的危害極大，因此針對(duì)魚(yú)源鏈球菌的研究也不斷深入。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)魚(yú)源鏈球菌病的研究主要集中在病原菌分離鑒定、流行病學(xué)調(diào)查、檢測(cè)手段、防治方法及致病機(jī)理等方面（張生等，2007；辛年香和蔡延渠，2017）。柒壯林（2012）從廣西羅非魚(yú)流行病暴發(fā)區(qū)（宜州、柳州、北海）的病魚(yú)體內(nèi)分離獲得3株菌株，經(jīng)細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察和基因序列分析，確定宜州分離株為海豚鏈球菌，柳州和北海分離株為無(wú)乳鏈球菌。張德鋒等（2017）通過(guò)分析2007～2015年我國(guó)羅非魚(yú)主產(chǎn)區(qū)無(wú)乳鏈球菌的分子特征及流行情況，發(fā)現(xiàn)近年來(lái)我國(guó)羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌發(fā)生了明顯的遺傳變異，且推測(cè)其主要是通過(guò)苗種或水體等介質(zhì)傳播，屬于輸入性傳播方式。在魚(yú)源鏈球菌病的防控方面，Al-hebshi等（2006）研究表明，阿拉伯茶水提物與四環(huán)素聯(lián)用時(shí)，四環(huán)素對(duì)鏈球菌的最小抑菌濃度（MIC）從16 gg/mL降至4 1ag/mL；Rattanachaikunso-pon和Phumkhachom（2009）、Wu等（2013）研究證實(shí)，于疫病流行季節(jié)在基礎(chǔ)餌料中適當(dāng)添加黃芪多糖、酵母多糖、維生素C、苦參、穿心蓮等免疫增強(qiáng)劑，能有效增強(qiáng)魚(yú)體的抗病能力，減少發(fā)病死亡；劉亮（2013）研究發(fā)現(xiàn)，給羅非魚(yú)投喂含1%黃連的餌料可促使其產(chǎn)生80%的相對(duì)保護(hù)率。[本研究切入點(diǎn)]原兒茶酸廣泛存在于穿心蓮、冬青、葒草、丹參、五味子、翻白草等常用中藥和可食用蔬菜水果中，是一種水溶性酚酸成分，具有抑菌（Liu et a1.，2005）、抗癌（Yip et a1.，2006）、抗炎（Min et a1.，2010）和抗氧化（張秀麗等，2011）等藥理作用；綠原酸存在于忍冬科忍冬屬、菊科蒿屬植物中，也具有抑菌（王宏軍等，2003）、抗炎（楊斌等，2009）和抗腫瘤、抗氧化（武雪芬等，1999）等藥理作用，但至今有關(guān)原兒茶酸或綠原酸與抗菌藥聯(lián)合作用于魚(yú)源鏈球菌的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。[擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題]檢測(cè)原兒茶酸或綠原酸與供試抗菌藥聯(lián)用時(shí)誘導(dǎo)魚(yú)源鏈球菌傳代的體外抑菌活性，采用微量棋盤(pán)稀釋法測(cè)定配伍后的MIC，并以此計(jì)算配伍組合的部分抑菌濃度指數(shù)（FICI），判斷配伍藥物組合間是否存在協(xié)同或相加效應(yīng)，為魚(yú)源鏈球菌病的綜合防治提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

魚(yú)源鏈球菌由廣州海大集團(tuán)股份有限公司饋贈(zèng)；原兒茶酸購(gòu)自南京澤朗生物科技公司；綠原酸購(gòu)自南京道斯夫生物科技公司；腦心浸液（BHI）瓊脂培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基、BHI營(yíng)養(yǎng)肉湯、犢牛血清和細(xì)菌生化鑒定管均購(gòu)自杭州天河微生物試劑有限公司；痢菌凈（Mequindox）、阿米卡星（Amikacin）、粘菌素（Colistin）、磺胺間甲氧嘧啶鈉（Sulfamonomethoxine）、克林沙星（clinafloxacin）和磷霉素（Fosfomycin）均為國(guó)產(chǎn)抗菌藥，且在有效期內(nèi)。

1.2菌株培養(yǎng)鑒定

取保存于30%甘油中的魚(yú)源鏈球菌接種于BHI肉湯培養(yǎng)基（添加5%犢牛血清）中，37℃振蕩培養(yǎng)6 h后取培養(yǎng)物劃線(xiàn)接種于BHI瓊脂培養(yǎng)基（添加5%犢牛血清）上，37℃培養(yǎng)12 h，從培養(yǎng)基上挑取白色菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，然后進(jìn)行菌落涂片鏡檢、觸酶試驗(yàn)及血瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)確認(rèn)其溶血特性，并按細(xì)菌生化鑒定管使用說(shuō)明對(duì)純培養(yǎng)所得菌株進(jìn)行生化鑒定。

1.3抗菌藥、原兒茶酸和綠原酸溶液制備

1.3.1抗茵藥溶液制備 參照CLSI推薦的方法進(jìn)行抗菌藥溶液制備（劉增援，2016）。

1.3.2原兒茶酸和綠原酸溶液制備 準(zhǔn)確稱(chēng)取原兒茶酸300 mg、綠原酸180 mg，分別溶于15 mEN菌水，經(jīng)無(wú)菌濾頭過(guò)濾所得溶液濃度：原兒茶酸20000μg/mL，綠原酸12000 Bg/mL。

1.4原兒茶酸或綠原酸與抗菌藥聯(lián)合抗菌試驗(yàn)

1.4.1MIC檢測(cè) 參照CLSI推薦的方法和結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)（劉增援，2016），采用微量二倍稀釋法測(cè)定原兒茶酸、綠原酸及各種抗菌藥對(duì)魚(yú)源鏈球菌的MIC。

1.4.2原兒茶酸或綠原酸聯(lián)合抗菌藥誘導(dǎo)細(xì)菌傳代 以1/2MIC的原兒茶酸或綠原酸溶液分別聯(lián)合抗菌藥誘導(dǎo)魚(yú)源鏈球菌進(jìn)行傳代培養(yǎng)，聯(lián)合傳代培養(yǎng)后的MIC與單獨(dú)抗菌藥的MIC進(jìn)行比較，確定聯(lián)合傳代培養(yǎng)后的抗菌藥MIC是否變小，以此判斷原兒茶酸或綠原酸聯(lián)合抗菌藥對(duì)該耐藥菌傳代培養(yǎng)是否具有增強(qiáng)抑制作用。

1.4.3微量棋盤(pán)稀釋法 以微量棋盤(pán)稀釋法分別對(duì)原兒茶酸、綠原酸與抗菌藥的組合進(jìn)行二倍倍比稀釋?zhuān)幬锘プ餍?yīng)通過(guò)計(jì)算其部分抑菌濃度指數(shù)（FICI）來(lái)判斷，具體操作及判定標(biāo)準(zhǔn)參照NCCLS（劉增援，2016）。

FICI=MIC_A聯(lián)/MIC_A+MTC_B聯(lián)/MIC_B

其中，A表示抗菌藥，B表示原兒茶酸或綠原酸。判定標(biāo)準(zhǔn)：FICI≤0.500表現(xiàn)為協(xié)同作用，0.5002結(jié)果與分析

2.1菌株培養(yǎng)鑒定結(jié)果

2.1.1菌株形態(tài)特征將魚(yú)源鏈球菌劃線(xiàn)接種于BHI瓊脂培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)12 h后，發(fā)現(xiàn)其菌株生長(zhǎng)良好，菌落邊緣整齊、呈白色（圖1-A）；在血瓊脂培養(yǎng)基上形成的菌落呈灰白色、表面光滑、邊緣整齊，且呈B溶血（圖1-B）。鏡檢發(fā)現(xiàn)，菌株革蘭氏染色呈陽(yáng)性，球形，鏈狀排列（圖1-C）。

2.1.2觸酶試驗(yàn)結(jié)果 無(wú)菌條件下，用接種環(huán)在分離菌株的新鮮培養(yǎng)物中挑取菌落形態(tài)、顏色一致的單個(gè)菌落置于載玻片上，滴加少量的3%H202，未產(chǎn)生氣泡，即判定觸酶試驗(yàn)呈陰性。

2.1.3生化鑒定結(jié)果 以純化獲得的菌株進(jìn)行生化鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株可水解七葉苷和精氨酸，其V-P、脲酶和馬脲酸試驗(yàn)均呈陰性，能發(fā)酵葡萄糖、水楊苷、蔗糖和淀粉，但不發(fā)酵阿拉伯糖、菊糖、乳糖、蜜二糖、棉子糖和山梨醇。參照Berridge等（1998）的研究結(jié)果，可判定為鏈球菌。

2.2原兒茶酸、綠原酸及各供試抗菌藥的MIC

采用微量二倍稀釋法測(cè)定原兒茶酸、綠原酸及各供試抗菌藥對(duì)魚(yú)源鏈球菌的MIC，結(jié)果表明，原兒茶酸的MIC=2500μg/mL，綠原酸的MIC=6000μg/mL，因此后續(xù)試驗(yàn)中原兒茶酸和綠原酸的1/2MIC分別為1250和3000μg/mL。由表1可看出，各抗菌藥對(duì)魚(yú)源鏈球菌的MIC均很高，說(shuō)明本研究選用的魚(yú)源鏈球菌對(duì)這些供試抗菌藥已產(chǎn)生耐藥性。

2.3原兒茶酸或綠原酸聯(lián)合各抗菌藥誘導(dǎo)魚(yú)源鏈球菌傳代的結(jié)果

由表2可看出，原兒茶酸與痢菌凈或克林沙星，綠原酸與阿米卡星或克林沙星聯(lián)合誘導(dǎo)魚(yú)源鏈球菌傳代后，抗菌藥對(duì)第一代菌株的MIC降低了200%或200%以上。原兒茶酸與磺胺間甲氧嘧啶鈉聯(lián)合誘導(dǎo)魚(yú)源鏈球菌傳代后，磺胺間甲氧嘧啶鈉對(duì)傳代獲得菌株的MIC無(wú)任何變化，始終保持在3200.00μg/mL；綠原酸與磺胺間甲氧嘧啶鈉聯(lián)合誘導(dǎo)魚(yú)源鏈球菌傳代后，磺胺間甲氧嘧啶鈉對(duì)第一代菌株的MIC反而增大，對(duì)第二、三代菌株的MIC仍保持在3200.00 μg/mL。其他藥物聯(lián)合誘導(dǎo)魚(yú)源鏈球菌傳代后，其抗菌藥對(duì)第一代菌株的MIC均降低了100%。可見(jiàn)，除磺胺間甲氧嘧啶鈉外，原兒茶酸或綠原酸與抗菌藥聯(lián)合誘導(dǎo)魚(yú)源鏈球菌傳代后，均可增強(qiáng)魚(yú)源鏈球菌對(duì)抗菌藥的敏感性，降低MIC。

2.4原兒茶酸或綠原酸與抗菌藥配伍的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，原兒茶酸與痢菌凈和克林沙星配伍后的FICI≤0.500，與阿米卡星、粘菌素和磷霉素配伍后的FICI分別為0.750、0.516和0.516，與磺胺間甲氧嘧啶鈉配伍后的FICI為1.125；綠原酸與阿米卡星和克林沙星配伍后的FICI≤0.500，與痢菌凈、粘菌素和磷霉素配伍后的FICI分別為0.501、0.501和0.563，與磺胺間甲氧嘧啶鈉配伍后的FICI>2.000。依據(jù)FICI的判定標(biāo)準(zhǔn)可知，原兒茶酸與痢菌凈和克林沙星配伍后呈協(xié)同效應(yīng)，與阿米卡星、粘菌素和磷霉素配伍后呈相加效應(yīng)，與磺胺間甲氧嘧啶鈉配伍表現(xiàn)為無(wú)關(guān)效應(yīng)；綠原酸與阿米卡星和克林沙星配伍呈協(xié)同效應(yīng)，與痢菌凈、粘菌素和磷霉素配伍呈相加效應(yīng)，與磺胺間甲氧嘧啶鈉配伍則呈拮抗效應(yīng)。

3討論

鏈球菌是危害水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的主要致病菌之一，可感染多種魚(yú)類(lèi)，包括羅非魚(yú)、日本鲆、鰻魚(yú)和虹鱒等，同時(shí)能在不同種類(lèi)的魚(yú)群間進(jìn)行交叉?zhèn)鞑?，甚至還會(huì)通過(guò)傷口感染人類(lèi)（Lehane and Rawlin，2000；郭長(zhǎng)明等，2017）。目前，廣西不同地區(qū)的羅非魚(yú)源鏈球菌均已產(chǎn)生不同程度的耐藥性，其中南寧地區(qū)無(wú)乳鏈球菌的耐藥率高達(dá)100%（呂小麗等，2017），其耐藥性的產(chǎn)生對(duì)該病的防治提出了更大挑戰(zhàn)。已有研究表明，原兒茶酸和綠原酸對(duì)多種細(xì)菌具有抑制作用（王宏軍等，2003；Liu et a1.，2005），但近年來(lái)的研究主要集中在抗炎、抗氧化、抗病毒方面，有關(guān)二者與抗菌藥配伍作用于細(xì)菌的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本課題組前期的研究表明，將中藥提取物與抗菌藥聯(lián)合使用可顯著降低抗菌藥的MIC，如救必應(yīng)水提物與阿莫西林聯(lián)合作用于產(chǎn)ESBLs細(xì)菌，阿莫西林的MIC從640.00 μg/mL降至80.00 μg/mL（宋劍武等，20 14）；爬山虎水提液與氟苯尼考聯(lián)合作用于大腸桿菌后，氟苯尼考的MIc從500.00μg/mL降至3 1.25μg/mL（吳永繼等，2015）；并通過(guò)研究其抑菌機(jī)理證實(shí)，救必應(yīng)黃酮類(lèi)提取物的加入可破壞大腸桿菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，影響細(xì)菌蛋白和DNA的合成，從而加速細(xì)菌凋亡或死亡（劉增援，2016）。但關(guān)于單一植物成分抑菌作用靶點(diǎn)的研究尚處于起步階段，植物酚類(lèi)成分的研究結(jié)果顯示，表倍兒茶素通過(guò)抑制細(xì)菌外排泵的作用而提高四環(huán)素的抑菌效果（Sudano eta1.，2004），槲皮素可抑制細(xì)菌拓?fù)洚悩?gòu)酶和蛋白激酶的活性（Shakrya et a1.，2011），綠原酸可破壞大腸桿菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜。

本研究將原兒茶酸和綠原酸分別與抗菌藥聯(lián)合作用于魚(yú)源鏈球菌，結(jié)果表明，除磺胺間甲氧嘧啶鈉外，原兒茶酸或綠原酸與抗菌藥聯(lián)合誘導(dǎo)魚(yú)源鏈球菌傳代后，均可增強(qiáng)魚(yú)源鏈球菌對(duì)抗菌藥的敏感性，降低MIC，其中，原兒茶酸與痢菌凈和克林沙星配伍呈協(xié)同效應(yīng)，與阿米卡星、粘菌素和磷霉素配伍呈相加效應(yīng)；綠原酸與阿米卡星和克林沙星配伍呈協(xié)同效應(yīng)，與痢菌凈、粘菌素和磷霉素配伍呈相加效應(yīng)。原兒茶酸和綠原酸均屬于酚類(lèi)化合物，鑒于二者結(jié)構(gòu)的相似性，故推測(cè)本研究中呈協(xié)同和相加效應(yīng)的表現(xiàn)是由于原兒茶酸、綠原酸與細(xì)胞壁合成抑制劑類(lèi)、細(xì)胞膜合成抑制劑類(lèi)、蛋白質(zhì)合成抑制劑類(lèi)、DNA合成抑制劑類(lèi)等抗菌藥有相同或相似的作用靶點(diǎn)。在本研究中，原兒茶酸與磺胺間甲氧嘧啶鈉配伍表現(xiàn)為無(wú)關(guān)效應(yīng)，綠原酸與磺胺間甲氧嘧啶鈉配伍則呈拮抗效應(yīng)，與Jayaraman等（2010）研究報(bào)道原兒茶酸與磺胺間甲氧嘧啶鈉聯(lián)合作用于綠膿桿菌時(shí)呈協(xié)同效應(yīng)的結(jié)論存在明顯差異。因此，有關(guān)原兒茶酸和綠原酸的抑菌機(jī)理及其與抗菌藥聯(lián)用的增效或拮抗機(jī)制有待進(jìn)一步探究證實(shí)，旨在更好地完善中西藥配伍組合防治魚(yú)源鏈球菌病的綜合防控體系。

4結(jié)論

原兒茶酸與痢菌凈和克林沙星配伍呈協(xié)同效應(yīng)，與阿米卡星、粘菌素和磷霉素配伍呈相加效應(yīng)；綠原酸與阿米卡星和克林沙星配伍呈協(xié)同效應(yīng)，與痢菌凈、粘菌素和磷霉素配伍呈相加效應(yīng)。即原兒茶酸或綠原酸與抗菌藥配伍后能增強(qiáng)大部分抗菌藥對(duì)魚(yú)源鏈球菌的抑菌活性，呈協(xié)同或相加作用，可在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）